第四节　发酵法制备

利用发酵法制备多糖、寡糖、单糖，具有生产周期短、不受季节、地域和病虫害条件的限制等优点，因此有较强的市场竞争力。据统计，目前全世界微生物糖产业年加工产值可达100亿美元左右。

一、发酵法制备多糖

发酵法制备微生物多糖主要是利用淀粉为碳源，经过微生物的发酵进行多糖的制备，也有通过利用微生物产生的酶来制备多糖。能够产生多糖的微生物种类较多，但是真正有应用价值并已进行或接近工业化生产的仅十几种。近几年，随着对微生物多糖研究的深入，世界上微生物多糖的产量逐年增加，年增长量在10%以上。目前，利用发酵法可以进行规模化生产的多糖有右旋糖酐（dextran）、透明质酸（hyaluronic acid）、黄原胶（xanthan gum）、普鲁兰多糖（pullulan）、结冷胶（gellan gum）、食用菌多糖等。

1.右旋糖酐

右旋糖酐（dextran）又称葡聚糖，是在右旋糖酐蔗糖酶作用下，若干葡萄糖经脱水后以多种α-型糖苷键连接构成的高分子多糖化合物。右旋糖酐无毒、无臭、无味、透明、黏性高，具有良好的水溶性和成膜性，广泛用于制药、食品、农牧业、工业等领域。中分子量右旋糖酐是目前最佳的血浆代用品之一，右旋糖酐可降低血液黏滞性、改善微循环、扩充血容量，用于治疗出血性休克、创伤性休克；在食品加工中，右旋糖酐用作赋形剂、稳定剂和增稠剂；右旋糖酐还可作为原料合成右旋糖酐铁等药物。目前，右旋糖酐主要以含高浓度蔗糖为主要成分的培养基，通过肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）发酵生产制备。

2.透明质酸

透明质酸（hyaluronic acid，HA）又名玻璃酸，广泛存在于脊椎动物的各种组织细胞间质中。HA由β-D-葡糖醛酸和β-D-N-乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成，是一种高分子量的酸性黏多糖。HA分子中的羧基和极性基团可与水形成氢键而结合大量的水，可以吸收与保持自身重量千倍以上的水分，是国际上公认的最好的保湿剂，还具有润滑、促进关节愈合等作用。不同Mr的HA有不同的用途，低Mr的HA通常用作食品原料，中Mr的HA主要应用于化妆品，而高Mr的HA在医学上有较高的应用价值。

HA的传统制备方法是以动物组织为原料，主要从人脐带、鸡冠、牛羊眼的玻璃体中提取。受原料限制，从动物组织提取HA产量低、成本高，不能满足需求。利用微生物发酵法制备HA，与动物组织提取法相比，具有生产规模不受动物原料限制、发酵液中HA以游离状态存在、易于分离纯化、成本低、易于形成规模化工业生产、无动物来源的致病病毒污染的危险等优点，因此微生物发酵生产HA逐渐成为制备HA的主要方法。

能够产HA的菌种主要是链球菌属的A群和C群。A群主要是化脓链球菌等，由于其致病性较强，较少使用。C群致病性较弱，多采用此类菌，主要有兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）、马链球菌（Streptococcus equi）、类马链球菌（Streptococcus equi ssp.）等。但野生型的链球菌多数都产溶血素和透明质酸酶，链球菌溶血素有溶解红细胞、杀死白细胞和毒害心脏的作用；透明质酸酶能够降解HA，使HA的发酵产率降低。所以，规模生产一般是先通过诱变获得溶血素和透明质酸酶缺陷型的菌株，以提高HA的品质和产量。此外，还可利用基因工程菌株生产HA，例如，诺维信公司将类马链球菌（Streptococcus equi ssp.）的HA合酶基因导入枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）中，通过操纵HA合成途径中的关键步骤，可以最大限度地增加基因表达量，提高HA的产量并能控制其分子量。基因表达不需要使用特定的物质诱导，并且其分泌的HA产量高、易回收。这样构建的基因工程菌株既不会产生对人或动物有害的毒素，也不产生透明质酸酶，更适合生产一些高品质的HA。

3.黄原胶

黄原胶（xanthan gum，XG）又名黄单胞菌多糖，其基本结构是由重复的五糖单元组成，此单元由2个D-葡萄糖、2个D-甘露糖和1个D-葡糖醛酸组成。XG分子的一级结构由β-1，4糖苷键连接的D-葡萄糖基主链与三糖单位侧链组成，其侧链由D-甘露糖和D-葡糖醛酸交替连接而成，部分侧链末端的甘露糖4，6位C上连接1个丙酮酸基团，而部分连接主链的甘露糖在C-6位被乙酰化。它的相对分子质量在2×106～5×107D。由于黄原胶具有良好的增稠性、假塑流变性、水溶性、悬浮性、乳化稳定性、耐酸碱、抗盐、优良的复合性等特性，其应用覆盖面多达20多个行业，广泛应用于食品、医药、采油、纺织、陶瓷、印染、香料、化妆品、消防等领域。工业生产上发酵黄原胶的菌种一般采用野油菜黄单胞菌（亦名甘蓝黑腐病黄单胞菌）、菜豆黄单胞菌、锦葵黄单胞菌和胡萝卜黄单胞菌。

4.普鲁兰多糖

普鲁兰多糖（pullulan）又称为短梗霉多糖、茁霉多糖或茁霉糖，是由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）菌株在发酵过程中利用糖代谢产生的一种微生物胞外多糖。普鲁兰多糖是葡萄糖经两个α-1，4糖苷键连接成麦芽三糖，由α-1，6糖苷键聚合形成无分支结构的直链多糖，α-1，4与α-1，6糖苷键的比例是2∶1；聚合度为100～5000，Mr一般在5.0×104～5.0×106D之间，随菌种和发酵条件的不同而不同。普鲁兰多糖具有优良的理化性质和生物学特性，无色、无味，具有成膜性、黏结性、乳化性、吸附性、可以自然降解等特点，广泛应用于食品、医药、化妆品、石油等领域。

5.结冷胶

结冷胶（gellan gum）是少动鞘脂单胞菌ATCC31461生产的一种线性阴离子杂多糖，是由葡萄糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸按组成比例大约为2∶1∶1聚合而成。20世纪70年代末期发现了结冷胶，Kang等1982年首次报道了实验室规模通过假单胞菌成功生产结冷胶。结冷胶及结冷胶类多糖的商业规模生产是Kelco公司成功筛选微生物的结果。1988年，日本完成了结冷胶的毒理实验并准许结冷胶在食品中应用。1992年，美国食品药物监督管理局（FDA）批准结冷胶作为稳定剂和黏结剂在食品中的使用，成为第三种在食品中使用的微生物胞外多糖。除美国外，还有10多个国家批准其用作食品添加剂。在工业上发酵生产结冷胶的菌种主要使用少动鞘脂单胞菌（Sphingomona spaucimobilis）。

6.食用菌多糖

从真菌中寻找抗肿瘤及免疫调节活性成分备受瞩目，但是，由于许多真菌野生资源稀少、人工栽培难度大、价格昂贵等因素都限制了该类产品的研究与开发。而采用发酵法生产真菌并进一步提取多糖具有生产周期短、成本低、产量大、易于大规模生产的优点，是一种大量获得真菌多糖的有效途径，对真菌多糖在生命科学、医药科学的研究与开发有重要意义。常见的食用菌多糖来源及特性见表2-1。

二、发酵法制备寡糖

1.褐藻胶寡糖

褐藻胶是一种由多聚D-甘露糖醛酸（M）n和多聚L-古罗糖醛酸（G）n以一定规则排列组成的多糖，两者以交替的（M）n、（G）n或多聚交替（MG）n相连接。褐藻胶作为稳定剂、增稠剂、凝胶剂被广泛地应用于食品饮料、造纸印染、生物材料、医药卫生、科学研究等各个方面。最近的研究表明，褐藻胶寡糖具有许多特殊的生理功能，例如促进双歧杆菌的生长、预防龋齿、抗真菌及细菌、抗肿瘤、免疫增强等，因而越来越受到关注。褐藻胶产量大、价格便宜，是发酵生产褐藻胶寡糖的优良原料。以往用酶法制备褐藻胶寡糖，多是先分离纯化得到褐藻胶裂解酶后再制备寡糖系列产物，但酶的分离纯化比较烦琐，且在这一过程中酶也容易失活。有研究人员以褐藻胶为唯一碳源，直接通过发酵褐藻胶裂解酶产生菌Alteromonas sp.，诱导褐藻胶裂解酶的产生来制备褐藻胶寡糖。再者，也以褐藻胶为唯一碳源，利用Pseudoalteromonas elyakouii菌株发酵生产分子量10kD左右的褐藻胶。

2.海藻糖

海藻糖是由2个分子葡萄糖残基通过1个α，α-1，1糖苷键连接的非还原性二糖。最初是从生活在沙漠中的一种甲虫蛹里分离得到的，后来发现它广泛存在于低等植物（如藻类）、真菌、细菌、酵母和昆虫中。大量研究表明，海藻糖具有独特的生物学特性。在细胞中是一种典型的应激代谢物，当生物细胞处于饥饿、干燥、高温、高渗透压、有毒试剂等胁迫环境时，细胞质内海藻糖迅速积累，对生物体膜、蛋白质发挥保护作用。最近报道，海藻糖还能保护DNA防止射线引起的损伤。外源性的海藻糖对生物体和生物大分子同样具有良好的非特异性保护作用。在海藻糖存在的条件下，对保存条件苛刻的基因工程酶类、各种病毒、疫苗、抗体和重组人蛋白的干燥及复水后的功能与活性进行了研究，发现它们仍具有极好的稳定性和活性。随着对海藻糖生产技术与工艺的改进与创新，它将日益广泛地应用于医药、食品等许多领域。

从酵母中提取海藻糖的生产方法成本高、收率低。近年来发酵生产海藻糖的开发取得了突破性进展，并在细菌中发现了两类新酶系：海藻糖合酶、新型葡糖基转移酶与新型α-淀粉酶，这些酶以麦芽糖、淀粉或其水解物及寡糖为底物合成海藻糖。其中，以淀粉为原料发酵生成海藻糖有2种方法：一是超嗜热嗜酸性古细菌——硫矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）KM1，其细胞匀浆物中所含的新型葡糖基转移酶与新型α-淀粉酶联合作用于淀粉，经普鲁兰酶脱支后，可获得海藻糖，产率达80.2%～81.5%；二是从土壤中分离得到的节杆菌（Arthrabacter sp.）Q36，此菌产生的2种新酶——麦芽寡糖基海藻糖合酶（MTsase）与麦芽寡糖基海藻糖基水解酶（MTHase），可将麦芽寡糖转化为海藻糖。以MTsase、MTHase和异淀粉酶同时作用于淀粉，最终糖化液中海藻糖收率可达80%以上。除微生物酶法生产海藻糖外，还可发酵培养真菌制取海藻糖，如有人以淀粉质原料为培养基液态培养食用菌灰树花时，研究海藻糖与多糖在灰树花中积累的规律，为今后在生物反应器内综合开发利用食用菌的海藻糖与多糖资源提供了有价值的参考。

三、发酵法制备单糖

1.D-核糖

D-核糖是一种五碳糖，是组成RNA的糖，也是各种核苷酸辅酶的组成糖，其在生理上的重要性可与葡萄糖相比。D-核糖作为人体重要的能量代谢物质具有很好的改善心脏缺血、提升心脏功能、增强机体能量、缓解肌肉酸痛等功能，可以改善人们的生活质量。D-核糖的应用除作为食品添加剂、保健食品原料外，还可作为多种药物的合成原料。如D-核糖用于合成维生素B2、多种核酸药物等。近年来，核酸药物的发展，带动了由D-核糖合成抗病毒、抗肿瘤核苷酸药物的研究。由于化学合成法存在污染公害，故D-核糖的生产已被微生物发酵法所取代。

利用微生物发酵生产D-核糖的最初报道是1951年，在短密青霉（Penicillum brevicompactum）培养液中观察到微量的D-核糖，20世纪60年代，日本对 D-核糖的微生物发酵法生产进行了深入的研究，20世纪70年代初期，人们开始用发酵法对D-核糖实行了工业化生产，主要作为维生素B2的合成原料。微生物发酵法生产D-核糖的主要原料是碳源、氮源、无机物、微量元素。碳源可以使用葡萄糖、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、麦芽糖、乳糖、甘油、糊精以及可溶性淀粉等；有机氮源可以使用干酵母、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、棉子粉以及大豆粉；无机盐为硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵、碳酸铵等。生产用菌种有芽孢杆菌/棒状杆菌、短杆菌、节杆菌、假单孢杆菌及酵母菌等，报道较多的产核糖能力较强的菌种是短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌。同时，还开展了D-核糖发酵过程参数研究、添加物对D-核糖生物合成影响的研究，通过优化，发酵法生产D-核糖水平达到92g/L，已超过了谷氨酸的发酵水平。

2.1，6-二磷酸果糖

1，6-二磷酸果糖（fructose-1，6-diphosphate，FDP）是糖酵解的中间产物，是细胞内糖代谢过程中的中间产物，是一种在分子水平上改善细胞代谢的生化药物，有增加细胞内高能磷酸物质浓度、促进钾离子回流、恢复细胞极化状态的功能，从而有利于细胞在损伤、缺氧、休克等状态下对葡萄糖的代谢与利用，修复细胞损伤等。因此，它广泛应用于心血管疾病、休克及缺血缺氧疾病的急救和治疗。此外，FDP还具有减少血小板黏附、聚集和保护红细胞韧性的弯形能力，减低凝血和溶血作用。因此，它应用于体外循环的手术和血液净化治疗中。

目前，FDP的工业生产是利用啤酒酵母的磷酸化作用，以蔗糖和无机磷酸盐为底物进行发酵生产。我国是世界第一大啤酒生产国，啤酒废酵母资源十分丰富。利用生理盐水对啤酒废酵母进行洗涤，用卡拉胶对菌体进行固定化，随后用含底物的表面活性剂活化固定化的酵母细胞，以活化固定化细胞充填柱反应器，以上行法通入底物溶液（内含8%蔗糖，4%NaH2PO4，5mmol/L ATP，30mmol/L MgCl2）进行酶促转化后，利用离子交换方法进行纯化得到FDP精品；也可不对啤酒酵母进行固定化处理，用游离酵母菌进行FDP的发酵生产。