第二节　合成法制备

糖生物学和糖生物工程学的迅猛发展对结构均一的寡糖样品提出了迫切的要求，而提取自天然产物或者由天然多糖降解而来的寡糖样品往往因其结构的不均一性、较低的纯度和极低的收率难以用于实验研究，通过合成手段获得寡糖片段作为工具分子或者用于新糖类药物研发和生产，就成为了寡糖研究的必由之路，糖合成的发展也必将大大推动寡糖相关研究的发展。在生物体内，与蛋白质和核酸的合成不同，糖的合成不是有模板的复制，而是一个由多种糖基转移酶和糖苷酶共同调控完成的复杂过程。由于寡糖类分子中含有多个羟基且空间构型复杂多样，因此体外寡糖合成同样存在着固有的困难。寡糖合成的核心就是连接两个单糖单元的糖苷键的生成，根据糖苷键生成的方法不同，寡糖的合成可分为化学法和酶法两种途径，化学法和酶法联用即为化学酶法。

一、化学合成法

化学合成法（chemical synthesis）合成寡糖的关键是将两个糖单元采用一定的化学手段通过糖苷键相连，也就是糖苷化反应的发生。其中，在糖苷键的形成中提供异头位碳的糖单元称为糖基供体（glycosyl donor），提供进攻供体异头位碳羟基的糖单元是糖基受体（glycosyl acceptor）。糖基供体一般是异头位含有一个在糖苷化条件下容易活化的离去基团，其他位置上羟基均含有保护基的糖基砌块。糖基受体往往只裸露发生糖苷化反应位点的羟基，其他羟基被选择性保护。糖苷键的生成还需要特定的促进剂体系，以活化糖基供体或者促进某些反应中间体的生成。因此，糖苷键的形成（formation of glycosidic bond）就是在一定促进剂体系的存在下，将亲电的糖基供体异头位活化，并转移到亲核的糖基受体的受体位置羟基上的过程。其中，糖基供体和糖基受体都是通过一系列保护基的保护与脱保护操作而获得的。

糖基供体的异头位离去基团、供体受体的保护基以及促进剂，是糖苷化反应最基础最重要的影响因素，将在下面的内容中进行介绍。供体受体的合成路线、促进剂的用量、糖苷化反应的区域选择性和立体选择性以及反应收率的高低都是化学糖苷化方法选择中需要考虑的重要因素。

（一）糖苷化反应中的糖基供体和促进剂

1.糖基碘化物

糖基碘化物最早是用糖基溴化物转化的方法制备的，具有很高的供体活性，在反应时间、收率和产物的立体选择性方面都展现出了优于糖基溴化物、糖基氯化物的性质。Gervay-Hague小组采用糖基碘化物供体合成了多种寡糖结构。如图2-1所示，该小组以3，6位含有两个裸露羟基的甘露糖苷为糖基受体，碘基甘露糖苷为糖基供体，三氟甲磺酸银（AgOTf）为促进剂，在受体甘露糖苷的3，6位同时引入甘露糖单元，以91%的收率一步就得到了3，6-分支的三糖产物。然而，糖基碘化物供体由于活性过高，储存不便，使用时只能原位生成。

2.糖基硫苷

硫苷供体自1909年被报道后，一直广泛用于寡糖的合成并被不断发展。硫苷供体最大的优点在于其极佳的稳定性，仅在促进剂存在时发生反应，不活化时相当稳定，可耐受大部分保护基操作。因此，硫苷既可作为临时保护基，也可以用作糖基供体和糖基受体。常用的硫苷供体通常以硫乙基（SEt）、硫甲基（SMe）、对甲苯硫基（STol）、苯硫基（SPh）为离去基团。

硫苷一般由异头位为酰基的糖基和硫醇类化合物在三氟化硼乙醚（BF3·Et2O）等Lewis酸的存在下制备而得。糖苷化反应中，硫苷异头位首先被活化，然后含硫的苷元部分离去，进而糖基受体羟基与异头位碳连接。糖苷化反应产物的立体构型较为灵活，根据保护基、促进剂等反应条件的不同而生成不同构型的糖苷键。常见的硫苷供体促进剂体系有氮-碘代丁二酰亚胺-三氟甲磺酸（NIS/TfOH）体系，氮-溴代丁二酰亚胺-三氟甲磺酸（NBS/TfOH）、氮-碘代丁二酰亚胺-三氟甲磺酸银（NIS/AgOTf）等。

3.糖基三氯乙酰亚胺酯

三氯乙酰亚胺酯供体是由Sinay、Schmidt等发展起来的，在寡糖合成中的应用非常广泛。其制备过程相对简单，在适宜碱的存在下，异头位的裸露羟基与三氯乙腈（CNCCl3）反应即可得到相应的糖基三氯乙酰亚胺酯。糖苷化反应中，三氯乙酰亚胺酯离去，进而糖基受体羟基与异头位碳连接（图2-2）。糖苷化产物的立体构型、收率等受保护基、促进剂等的影响。三氯乙酰亚胺酯供体的稳定性不如硫苷供体，但仍能满足合成需要，且在很多糖苷化反应中表现出了良好的效率。促进剂通常为BF3·OEt2或催化量的三氟甲磺酸三甲基硅酯（TMSOTf）、AgOTf等Lewis酸。此外，三氯乙酰亚胺酯供体的类似物三氟乙酰亚胺酯供体具有更好的稳定性，在很多反应中也能得到良好的效果，并成功应用于一些三氯乙酰亚胺酯无法实现的糖苷化反应。

4.糖基原酸酯

原酸酯通常以糖苷化反应中间体的形式出现。在一定量促进剂存在的条件下，糖基供体二位保护基中的亲核基团代替糖基受体的羟基进攻供体的异头位碳正离子，就会生成原酸酯。继续加入更大量的促进剂、延长反应时间或者升高反应温度，原酸酯就可发生重排而生成所期望的糖苷化产物（图2-3）。由这种重排反应生成的往往是1，2-顺式糖苷键，因此糖基原酸酯供体常被用于立体选择性寡糖合成策略中。

5.邻羧基苄基糖苷

邻羧基苄基糖苷（2′-carboxybenzyl glycosides，CB）是Kim小组于2001年发展的一类新型糖基供体，以其为供体的糖苷化反应具有很好的立体选择性，反应收率也较高。

CB通常可以方便地由其前体化合物糖基2′-（苄氧羰基）苯甲酸苄酯（BCB）制得，且BCB前体在糖苷化反应条件下足够稳定，因此CB供体及其BCB前体可被用于寡糖的后期活化合成策略。CB供体先与BCB前体受体在促进剂条件下进行糖苷化，然后在催化氢化条件下将BCB还原成新的CB供体，继续进行糖苷化（图2-4）。酸性或碱性条件均可活化CB供体，常用的促进剂体系有三氟甲磺酸酐（Tf2O）、三氟甲磺酸酐-2，6-双特丁基-4-甲基吡啶（Tf2O/DTBMP）等。糖苷化反应中CB基团首先被促进剂活化、离去，糖基部分则成鎓离子OTf盐的中间体，然后与糖基受体成糖苷键（图2-5）。依所使用的糖苷化底物的不同，糖苷化反应的产物可为α或β构型，通常均具有较好的立体选择性。

6.糖基磷酸酯和磷酸盐

糖基磷酸酯最早是由相应的糖基三氯乙酰亚胺酯经亚磷酸转化制备而来。糖基磷酸酯供体有α、β两种构型，稳定性都很好，0℃可储存数月之久。然而，磷酸酯供体的活性要低于相应的三氯乙酰亚胺酯，其中α构型的活性还要低于β构型，往往需要更高的反应温度才能被活化。较低的供体活性使得糖基磷酸酯供体反应的选择性提高，可用于含有多个羟基的少保护受体或供体参与的糖苷化反应，实现反应的区域选择性（图2-6）。而α、β构型之间反应活性的差异可被用于发展异头位构型控制的寡糖合成策略。如图2-7，在糖基磷酸酯作为供体的糖苷化反应中，只有在硅基三氟甲磺酸类促进剂如TMSOTf的催化下才能获得较高的收率，且促进剂的加入量至少需要1个当量（与给体/供体物质的量之比为1∶1），最多可达3个当量（与给体/供体物质的量之比为3∶1）。此外，关注度较低的磷酸盐糖基供体用于合成1，2-反式糖苷键也有报道。

7.硝基烯糖

2位硝基取代的烯糖供体在糖苷化反应中的应用是由Schmidt小组发展起来的。2位硝基烯糖可以方便地由相应的糖基和乙酰硝酸酯在碱性条件下转化而来。此类供体最重要的用途就是α构型氮乙酰氨基半乳糖苷的合成，氮乙酰氨基半乳糖苷在自然界中广泛存在，然而由于2位氮乙酰氨基的邻基参与作用，以氨基酰基保护的半乳糖作为供体的大部分糖苷化反应的产物以β构型为主，难以得到天然的α构型产物。在此类糖苷化反应中，以2位硝基取代烯糖为供体，较低活性的醇羟基为受体，在低温和叔丁醇钾（tBuOK）等强碱性条件下，可高收率地生成α选择性的硝基糖糖苷或其氨基酸衍生物，硝基经还原和乙酰化即可得到含有2位氮乙酰氨基糖的产物（图2-8）。近来，俞飚小组发现该反应在弱的有机碱催化剂如4-二甲基氨基吡啶（DBU）或三乙胺条件下可以高收率地得到α选择性糖苷化产物。

8.其他糖基供体和促进剂体系

任何一种糖基供体都不能适用于所有的糖苷化反应，因此新型糖基供体的研究一直是糖化学研究的热点。除以上介绍的应用较多的供体外，其他的糖基供体还包括糖基碳酸酯（glycosyl carbonates）、多种杂芳基糖苷（heteroaryl glycosides）、多种氮取代的糖基甲酸酯（N-substituted glycosyl carbamates）、甲基-3，5-二硝基水杨酸糖苷（methyl 3，5-dinitrosalicylate glycosides）、糖基二硫化物（glycosyl disulfides）、糖基硫酰亚胺（glycosyl sulfimides）、N-糖基酰胺（N-glycosyl amides）、糖基邻苯二甲酸盐（glycosyl phthalates）、2-丙烯基苯基糖苷（2-allyloxyphenyl glycosides）、丙炔基糖苷（propargyl glycosides）等，相应的多种促进剂体系也在不断被研究报道。

（二）寡糖化学合成中的保护基

保护基是寡糖化学合成过程中必须涉及的重要部分，保护基的选择和保护基策略的设计直接关系到糖苷化反应的效果和整个寡糖合成的效率。理想的保护基试剂首先应便宜、易得、稳定并无毒，最好不带有或不引入手性中心而避免使体系过于复杂。此外，保护基在整个寡糖合成过程中应是稳定的，其引入及脱去收率也应定量，且脱保护后保护基部分与产物应容易分离。

在基团保护策略中必须考虑保护基的引入对糖环上其他功能基团活性和对糖苷化反应效果的影响。首先，不同种类的保护基对糖环的反应活性有不同的影响。酯类保护基由于其吸电子性会降低邻近羟基的亲核性，使糖环惰化，成苷活性降低。其次，供体异头位邻位的保护基团非常重要，它一方面会影响供体的成苷反应速率，如葡萄糖等六元吡喃糖的2位羟基上的保护基为醚类等供电子取代基会提高供体的反应活性，倾向于加速成苷反应，相反，如2位羟基为酰基等吸电子保护基会降低供体的反应活性，减慢糖苷化反应的速率；另一方面，异头位邻位羟基上的保护基团是邻基参与基团或非邻基参与基团，对糖苷化反应的立体化学控制往往起着至关重要的作用。另外，保护基可分为临时保护基和永久性保护基。在整个寡糖合成过程中不需转换的羟基保护基称作永久性保护基（permanent protecting group），其在整个合成流程中一直存在，直至最后才脱除；临时保护基（temporary protecting group）则用于暂时保护需要进行保护基转换或者脱保护的羟基，且它脱保护时不能影响其他保护基。

一种保护基要同时满足上述条件很不容易，因此，有关新的具有优良活性的保护基团的研究一直是糖化学研究的热点和重点。糖环中的羟基具有不同的活性，其活性取决于它是异头位羟基、伯羟基还是仲羟基。对于反应活性较高的羟基，一步保护基操作即可将其选择性地保护；反应活性较低的羟基，则需要一系列较为复杂的保护基操作。异头位碳上的羟基是糖环上最为活泼的羟基，往往需要在其他操作之前进行优先保护。异头位羟基保护绝大多数只是简单的成苷反应，常常可由Fisher糖苷化直接获得，也就是在Lewis酸的催化下环状半缩醛和烷基醇反应生成相应的缩醛。端基保护基还要求在其脱除时条件要较为温和，不影响糖与糖之间的苷键。

烷基糖苷（图2-9）可在酸水解的条件下脱除。其中，甲基糖苷相对最为稳定，需要在浓硫酸环境中在较高的温度下才能脱除；其他的如丙烯基糖苷和苄基糖苷等，用盐酸在二烷中即可水解脱除；2-（三甲基硅烷基）乙基（TMSEt）糖苷的水解条件更为温和，在三氟乙酸、ZnCl2、BF3·Et2O等条件下即可转化成相应的半缩醛、卤代糖及异头位酰基衍生物而不影响分子中的其他糖苷键。

此外，芳香类保护基也是一类重要的异头位羟基保护基。其中，4-甲氧基苯基保护的产物在许多反应条件下是稳定的，但是可在硝酸铈铵存在的条件下氧化脱除，或者在其他不同条件下转化为氯代及溴代糖或者苯硫苷。用硫苷保护异头位羟基的糖砌块也就是常见的硫苷供体，一方面可在特定条件下活化作为糖基供体，另一方面在其他大多数保护基操作的条件下却是很稳定的，是很好的异头位保护基。

1.酯类保护基

酯类保护基（ester protecting group）是糖化学中使用最为普遍的一类保护基，其中乙酸酯和苯甲酸酯最为常用。酯类保护基的引入非常方便，通常将相应糖与酸酐或酰氯在吡啶中反应即可。对游离糖进行全乙酰化往往是很多合成路线的第一步，全乙酰化糖再用于制备前述的各种供体，如溴代糖、硫代糖、三氯乙酰亚胺酯供体等。苯甲酰基也是众多糖基砌块的优选保护基。值得注意的是，若糖基供体异头位邻位羟基存在酯类保护基，则会对糖苷化产物的立体构型产生影响。一般情况下，受体羟基可从面上或者面下进攻供体异头位碳，从而可能生成α、β两种构型的糖苷化产物。当供体2位存在酰基保护基时，供体分子中2位上的酰基保护基的羰基氧会占据供体异头位碳顺式位置的空间从而使得受体只能从另一个面进攻异头位，从而更易生成1，2-反式构型的糖苷化产物（图2-10）。乙酸酯和苯甲酸酯这两种酯类保护基一般用Zemplen法，以催化量的甲醇钠在干燥的甲醇中脱保护获得。其中，苯甲酸酯较乙酸酯难断开，因此也可以选用其他脱保护方法实现乙酰基选择性脱除。

除上述最常用的两种酯类保护基，新戊酰基（Piv）在糖化学中也频繁应用。该酯在反应中可以避免发生酰基迁移，且在Koenigs-Knorr法糖苷化中较不易生成原酸酯。新戊酰基脱保护需要强碱性条件，如氢氧化钾的甲醇溶液、甲胺水溶液等。在乙酰基的α位引入卤原子，则形成了氯乙酰氯等卤代酯类保护基。由于保护基中卤素原子的吸电子作用，使亲核试剂更易对酯羰基进行进攻，而使得此类保护基较乙酰基容易脱除。

此外，还有多种酯类保护基（图2-11）广泛应用于糖合成中，且各具优势特色。乙酰丙酸酯类保护基可用肼在吡啶-乙酸中反应2分钟脱除，可区别于普通酯基；烯丙氧碳酸酯则具有很好的2位选择性；由糖环邻位二羟基与光气反应制得的碳酸酯，则可选择性保护邻位羟基，形成顺式五元环。

2.醚类保护基

醚键相对稳定，在不破坏糖环其他结构的条件下难以脱除，因此醚类保护基（ether protecting group）（图2-12）只能使用在相对温和的条件下即可断开的特殊醚类，如烷基醚中的苄基醚、烯丙基醚以及硅烷基醚等。

糖基苄醚的合成可以在NaH的存在下由溴化苄反应生成，反应中还可加入催化量的四丁基碘化铵以提高反应效率，但是，此强碱性反应条件对糖上存在碱敏感基团时不适用。与苄醚引入方法类似的另一种常用醚类保护基是对甲氧基苄基（PMB），常用作临时保护基。富电子的对甲氧基苄基醚比普通苄醚更不稳定，其氯化物在放置过程中就可降解。对甲氧基苄基醚对酸尤其不稳定，可用稀矿酸或樟脑磺酸（CSA）在甲醇中选择性脱去，也可用2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌（DDQ）或硝酸铈铵（CAN）氧化裂解（图 2-13）。

烯丙基醚也是一种应用非常广泛的醚类临时保护基。烯丙基的稳定性较高，对相当多的反应条件稳定，与许多常见的保护和脱保护操作以及糖基化条件兼容，包括中等强度的酸和碱。但烯丙基能与强的亲电试剂反应，并能够在催化氢化过程中被还原。也正是如此，烯丙基可以在非常温和的条件下断开，易于脱除。烯丙基的引入方法与苄醚类似，只是用溴丙烯替代溴化苄，而这种强碱性的制备过程一定程度上限制了烯丙基的适用范围。在烯丙基醚的脱除方法中，最常用的是通过过渡金属催化异构化为不稳定的丙烯基醚，后者再被温和的酸、碱性高锰酸钾水溶液、臭氧氧化或HgCl2/HgO在丙酮—水中断开。

近些年来，硅烷基醚在糖化学反应中应用越来越广泛。硅烷基醚的优点很多，其引入及脱除条件都非常温和，不同保护基的相对稳定性也可以通过改变硅原子上的取代基进行调整。硅烷基醚的引入通常在温和的碱性催化剂如吡啶、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、咪唑等的条件下，使糖砌块上相应的羟基与氯代三烷基硅烷反应即可高收率获得。在脱保护方面，三甲基硅烷基醚（TMS）普遍对酸、碱水解及氟离子敏感，通常用AcOH等弱酸或者四正丁基氟化铵等含氟试剂即可实现高收率选择性脱保护，而对其他保护基不产生影响。在寡糖合成中最常用的硅烷基为叔丁基二甲基硅烷基（TBDMS）、叔丁基二苯基硅烷基（TBDPS）和三乙基硅烷基（TES）。与硅原子相连的烷基不同，相应保护基的稳定性也不同，通常烷基越大硅烷醚越不容易水解。常用硅烷醚对酸的稳定性顺序为TMS﹤TES﹤TBDMS﹤TIPS（硅烷基缩酮 1，1，3，3-四异丙基二硅亚烷基）﹤TBDPS。最简单的TMS对酸最为敏感，且烷基化活性最高，很容易得到完全TMS保护的糖苷。而TBDMS和TBDPS的稳定性较高，其中后者对酸的稳定性比前者高250倍，苯基的存在使保护基的立体位阻增大而羟基选择性提高。脱保护时，TMS也可在不影响其他硅烷基的温和酸性条件下脱除。

硅烷基醚广泛应用后，三苯甲基醚类保护基用于糖合成的重要性逐渐减弱。该醚的体积较为庞大，常用于区域选择性地保护糖的伯羟基，方法是，糖衍生物与氯代三苯甲烷（TrCl）在吡啶中反应即可，反应中往往还需加入4-二甲氨基吡啶（DMAP）或DBU以加快反应速度。三苯甲基醚的脱除方法均基于其分子中碳正离子的性质，很易被温和的质子酸、Lewis酸水解，催化氢化、HClO4-H2SO4室温反应等多种方法均可高收率实现该保护基脱除。

3.缩醛及缩酮类保护基

缩醛及缩酮类保护基（acetal and ketal protecting group）（图2-14）中最为常用的是苯亚甲基缩醛和异亚丙基缩酮，也就是苄叉和丙酮叉。这些缩醛、缩酮类保护基具有很好的区域选择性，能够选择性地锁住1，2-顺式或1，3-顺式/反式两个相邻羟基。制备时，一般在酸催化的条件下，用相应的醛或酮在热力学或动力学控制下生成不同立体构型的产物，往往会引入新的手性中心。所生成的缩醛或缩酮对强碱性条件稳定，但对酸很敏感，因此通常在酸性条件下脱保护。

（1）苯亚甲基缩醛：

苯亚甲基缩醛（benzylidene acetal），也称苄叉，常用于选择性地保护吡喃己糖的4，6-位羟基。苄叉保护的反应条件较温和，使用苯甲醛二甲缩醛在催化量酸，如氯化锌（ZnCl2）、樟脑磺酸（CSA）、对甲苯磺酸（p-TsOH）等的存在下形成环状缩醛。这种条件下更易形成六元环，且向分子中引入了一个新的手性中心，一般得到的产物是非对映异构体的混合物。对半乳糖苷得到的是顺式产物（图2-15）。

苯亚甲基缩醛的脱保护条件很多，可在温和酸的水溶液中水解，如80%醋酸、三氟乙酸的二氯甲烷与水混合溶液等；还可用氢氧化钯炭或钯炭（Pd（OH）2/C或Pd/C）催化氢化断开。此外，还可以采用不同的试剂实现区域选择性地断开缩醛，在苄叉保护的两个羟基上分别产生一个单苄基保护的羟基和一个裸露羟基。实现选择性脱苄叉的试剂也有多种，不同条件下苄叉脱除的选择性不同，可分别释放C4-位羟基、C6-位羟基或者生成两者一定比例的混合物。以二异丁基氢化铝（diisobutylaluminum hydride，Dibal-H）或氢化锂铝-氯化铝（LiAlH4-AlCl3）为酸在乙醚中还原开环，可选择性地释放位阻较小的C6-位羟基；而用氰代硼氢化钠在HCl/乙醚（NaBH3CN-HCl）中或二甲胺基甲硼烷-氯化铝（BH3·NMe2-AlCl3）条件下，则会得到区域选择性相反的C4-位羟基裸露产物。

（2）异亚丙基缩酮：

异亚丙基缩酮（isopropyl ketal），也称丙酮叉，在糖化学中用于选择性保护顺式1，2-二醇或顺式1，3-二醇。随着反应条件的不同，既可生成五元环也可生成六元环。此外，反应中还可出现多保护产物，产物中保护基的个数也随反应试剂的不同而变化。在通常采用的缩醛交换制备法中，以2，2-二甲氧基丙烷在催化量CSA作用下引入丙酮叉。在热力学过程控制下，产物往往为较为稳定的顺式五元环，而较不稳定的顺式六元环产物也可在动力学条件下获得，如2-甲氧基丙烯在CSA催化下，则会优先选择糖环上活性较好的伯羟基成键而后环合，从而得到1，3-顺式六元环产物（图2-16）。另外，用不同种类的Lewis酸分别与丙酮反应则可生成单保护或多保护的产物。比如，在丙酮和硼酸、硫酸的条件下，可使D-甘露糖醇生成三个丙酮叉全保护的甘露糖砌块；而以ZnCl2催化则可得仅链端被保护的双丙酮叉保护甘露糖（图2-16）。

与苄叉脱保护类似，丙酮叉的脱保护反应也需要在酸性条件下进行。每种丙酮叉糖砌块的脱保护条件都需要逐个摸索，可供选择的酸性脱保护条件有不同浓度的醋酸、硫酸—甲醇水溶液、硅胶或酸性离子交换树脂等。此外，在糖苷中含有不止一个丙酮叉保护基时，由于这些丙酮叉的稳定性不同，因此可以通过控制反应条件选择性地断裂其中一个或几个缩酮键。

苄叉和丙酮叉都更适用于1，2-或1，3-顺式二醇的选择性保护，对于反式二醇则不够理想。作为补充，近些年发展起来的双螺旋二缩酮（dispiroketal）和环己烷-1，2-二缩酮（CDA）则更适用于 1，2-反式二醇的选择性保护。 对于 dispiroketal保护基，可在 3，3′，4，4′-四氢-6，6′-双-2H-吡喃和催化量CSA的条件下引入，收率高达80%以上，且反应的选择性很高，只生成一种立体构型的产物。CDA的热稳定性高于dispiroketal，甲醇中的溶解性也较好，因此可用于在热力学控制条件下生成甘露糖的1，2-反式二醇砌块，又因其对酸的稳定性较前者更低，因此CDA的使用日益频繁。

（3）硅烷基缩酮：

硅烷基缩酮 1，1，3，3-四异丙基二硅亚烷基（TIPS）可看作硅烷醚，它的突出优势在于既可以选择性地保护顺式1，2-二醇也可以保护反式二醇。其制备过程并不复杂，可用相应的糖苷与 1，3-二氯-1，1，3，3-四异丙基二硅亚烷在弱碱性条件下反应，常用的弱碱包括吡啶、咪唑等。反应首先生成动力学产物八元环，再在酸催化下重排为热力学更为稳定的七元环TIPS缩酮。脱保护条件也很温和，与前述硅烷基保护基一样，对酸、碱及氟离子都很敏感。

除上述环状缩醛、缩酮类保护基外，还有一些非环缩醛保护基，如四氢吡喃（THP）、甲氧甲基（MOM）、甲氧乙氧甲基（MEM）、甲硫甲基（MTM）、苄氧甲基（BOM）等。其中THP最常用，用于选择性地保护伯羟基，由二氢吡喃在二氯甲烷中制备，但往往产物中非对映异构体的分离较困难。其他保护基常用相应的氯化物在碱的条件下引入，酸性条件下脱除。

4.氨基保护基

氨基糖在自然界中分布相当广泛，由于其活泼的亲电性在糖化学中常需要进行保护。进行糖苷化的氨基糖常以N-邻苯二甲酰亚胺、N-乙酰及叠氮的形式存在，常用的氨基保护基（amino-protecting group）见图2-17。

N-乙酰基可以很方便地获得，将氨基糖与乙酸酐在水中直接选择性酰化即得。很多氨基糖是以N-乙酰氨基糖的形式存在的，因此在需要N-乙酰化糖产物时乙酰基就是适宜的保护基。但常用的羟基保护基乙酰基却不是良好的氨基保护基，因为乙酰基保护的氨基糖多数反应活性都很低，因此N-乙酰氨基糖特别不适宜作为糖基供体。此外，乙酰基也不易从氨基上脱除，需要强酸或强碱性条件，因此通常也不用作临时性保护基。

三氯乙氧羰基（Troc）和羟基保护基烯丙氧羰酰基（Alloc）是常用的氨基临时保护基，广泛应用于糖合成（图2-18）。其中Troc的羰基具有类似酰基保护的邻基参与作用，作供体时更易生成β糖苷键。Troc可用2，2，2-三氯乙氧羰酰氯在碳酸氢钠等弱碱条件下引入。脱除时，用锌粉在乙酸中温和地、选择性地脱去。

作为乙酰基的替代，邻苯二甲酰基（Phth）是糖化学中广泛应用的氨基保护基。其制备方法也较方便，可通过氨基与邻苯二甲酸酐在碳酸钾（K2CO3）、三乙胺或吡啶等碱性条件下引入。Phth在糖合成中的稳定性也较好，但脱除时需要用到大量的肼、硼氢化钠（NaBH4）、丁胺、羟胺、乙二胺等，对糖环中的碱敏感基团有影响。后来新发展的四氯邻苯二甲酰基（TCP）可在非常温和的条件下，如在乙二胺存在下，在乙腈/四氢呋喃/乙醇（MeCN/THF/EtOH）中即可成功脱除。

此外，在氨基糖参与的合成过程中，为了遮蔽氨基或者规避酰基保护基的邻基参与作用对糖苷化产物立体构型的影响，常常先将氨基转化为叠氮基团，糖苷化反应结束后再采用催化氢化等方法将叠氮还原成氨基。

保护基策略在整个糖合成路线中非常重要，经验告诉我们，应尽量减少使用保护基的种类，且在多步合成的最后一步脱保护时最好只有一种类型的保护基。除上述四大类常规保护基外，还有一些不常见的保护基用于解决特殊的保护问题，如光敏保护基和酶选择性保护和脱保护策略等。

（三）糖苷化反应

糖苷化反应（glycosidation reaction）就是在糖基供体和糖基受体之间形成糖苷键的过程。从Michael和Fischer发展的第一个糖苷化反应，到Koenigs-Knorr的开创性工作，科学家们发展了大量的糖苷化反应的方法。

1.Fisher糖苷化

Fisher糖苷化这一古老的糖苷化方法是1893年由Fisher完成的一个缩醛合成反应而来的。该方法的原理是糖异头位的氧交换反应，该反应是可逆的。此法操作简单，游离糖在酸性条件下以简单醇为溶剂高温反应即可。反应时间短，生成动力学控制产物如呋喃糖苷；时间长，可生成热力学控制产物如吡喃糖苷（图2-19）。但糖基供体（游离糖或半缩醛）活性低，因此只可用结构简单的活泼醇作为糖基受体。

2.Koenigs-Knorr糖苷化

基于经典的Koenigs-Knorr反应的糖苷化方法是长期以来广泛使用的寡糖合成方法。在经典Koenigs-Knorr反应中，异头位卤代糖作为糖基供体，并在特定促进剂条件下被活化，进而与受体成苷（图2-20）。其中，促进剂的用量一般较大，在1～4个当量之间。反应中往往还需要加入位阻碱等特定的试剂，以实现供体向受体的不可逆转移。此反应的精髓在于，向糖基供体中引入了一个相当于预活化的离去基团，该基团在糖苷化反应中被活化，促使异头位不可逆氧交换反应的发生。后来的各种改进都是基于这一思路，发展了新的离去基团如氟苷、溴苷等。

目前，任何一种糖苷化反应都不可能实现每一个糖苷化反应。但优秀的糖苷化方法的目标是大体一致的：首先要有一个较稳定的糖基供体，该供体能够在特定条件下顺利活化使糖异头位产生一个良好的离去基团；然后，加入催化量而非大大过量的促进剂，即可实现糖基供体向糖基受体的转移，生成立体构型单一的糖苷化产物。溴苷、氯苷和糖基碘化物作糖苷化供体，活化剂有重金属银盐、汞盐、氯化亚锡 SnCl2、季铵盐 N-溴苯基甲基叔丁基胺（Bt3NCH2PhBr）-等，但糖基碘化物较不稳定（图2-21）。Mukaiyama首先发展了以糖基氟化物作为离去基团的方法，其特点在于需要亲氟的活化剂，常用的是氯化亚锡-高氯酸银（SnCl2-AgClO4），该种糖苷化反应的产物构型受糖环其他位置尤其是异头位邻位保护基的影响而不同。2位有邻基参与基团时，对于葡萄糖和半乳糖产物为β构型，而甘露糖则可获得α构型糖苷。

3.硫苷及其类似物法

硫苷供体一般较稳定，被活化后作糖苷化反应的供体，其可经历多种保护基操作并能用作糖基受体。常用的促进剂包括传统的汞盐、铜盐和近些年新发展的便捷、迅速、高效的经典NIS/TfOH等促进剂体系。硫苷法因其灵活、便捷和高效性广泛用于多种复杂寡糖的合成。翁啟惠小组基于硫苷的双功能性发展了寡糖合成的预活化策略，与程序化“一锅法”相结合高效完成了一系列结构复杂的寡糖合成，如重要的肿瘤表面糖抗原 Lewis Y（图 2-22）。

4.三氯乙酰亚胺酯法

Schmidt等发展的这一方法以糖基三氯乙酰亚胺酯为供体，其中的三氯乙酰亚胺酯基是极佳的离去基团（图2-23）。供体制备过程相对简单，储藏时通常也较为稳定。促进剂通常为等当量的三氟化硼乙醚（BF3·OEt2）或催化量三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯（TMSOTf）或三氟甲磺酸银（AgOTf）。反应产物的糖苷键构型与供体糖环构型、糖环上其他位置保护基以及促进剂体系密切相关。三氯乙酰亚胺酯法因其灵活性、高效性被广泛重视和应用。此外，以磷酸酯、羧酸酯或者三氟乙酰亚胺酯为离去基团，在很多反应中也能收到良好的效果。

5.烯糖法

烯糖法使用烯糖作为糖基供体，在糖苷化反应中采用卤法令烯糖与适宜受体偶联（图2-24）。烯糖在碘、银盐及碱存在的条件下可以较好收率得到2-碘代糖苷，立体选择性也较好，产物中α～β选择性较高。烯糖糖苷化反应的促进剂包括碘二对称三甲基吡啶高氯酸盐（Iodonium di-sym-collidine perchlorate，IDCP）、N-溴代丁二酰亚胺（NBS）及 N-碘代丁二酰亚胺（NIS），所得产物可通过还原脱卤反应得到相应的2-去氧-α-糖苷。烯糖法广泛用于一系列糖基化天然产物的合成。

6.原酸酯法

用原酸酯法进行糖苷化反应，去除烷氧阴离子RO-，很容易形成环状乙酰阴离子活性中间体，反式开环得到β-糖苷键，对反应活性弱的羟基是一个很好的缩合方法。Kochetkov小组还在叔丁基原酸酯的基础上引入了氰代或硫乙亚基类似物（图2-25）。

7.n-戊-4-烯基成苷法

n-戊-4-烯基可用作异头位保护基从而减少保护基操作步骤。在糖苷化反应过程中，在亲电促进剂的作用下，n-戊-4-烯基转化成离去基团离去，与受体反应成苷（图2-26）。常见的促进剂体系为N-碘代丁二酰亚胺/三乙基硅烷三氟甲磺酸（NIS/TESOTf）或IDCP。糖环上保护基的种类对供体的反应活性影响非常明显，全苄基保护的糖有很好的供体活性，而全酰基保护的供体则很难被活化。因此，可实现两个n-戊-4-烯基苷的选择性活化而只生成一种糖苷化产物，减少了糖合成中异头位保护基转换步骤。

8.唑啉法

乙酰氨基糖基供体在糖苷化过程中通常容易形成2-位氮乙酰基上的羰基进攻异头位形成的1，3-唑啉中间体。在氰化汞（Hg（CN）2）等合适的促进剂存在下，1，3-唑啉中间体可以作为糖基供体被活化与受体分子偶联反应得到正常的糖苷化产物，对氨基葡萄糖或氨基半乳糖的1，3-唑啉供体所得到的糖苷化产物为β-糖苷键形式（图2-27）。

（四）复杂寡糖合成策略

从上述关于糖苷化反应的介绍中可以看出，寡糖的化学合成是一个形式丰富、过程复杂的领域。自然界中寡糖的结构往往非常复杂，一个完整的寡糖合成路线往往也步骤繁多。想要将上述糖苷化反应的各种方法顺利地运用于复杂寡糖的合成，就必须进行缜密的合成路线设计。针对不同结构的寡糖，其合成策略也会有所不同。

1.线性、汇聚式和双向寡糖合成策略

与复杂有机分子的合成策略相同，以寡糖为目标分子的合成路线也可分为线性合成（linear synthesis）和汇聚式合成（convergent synthesis）。此外，由于某些寡糖既可作为糖基供体也可作为糖基受体，因此对于寡糖合成还有一种双方向进行的双向合成（two-directional synthesis）策略。具体来说，线性合成策略就是采用以单糖为单位逐步延伸的思路，将单糖以一定构型的糖苷键按顺序依次连接成指定结构的寡糖（图 2-28）。

如图2-28所示，第一个异头位含有离去基团X的供体砌块A与异头位非活化的（Y）受体砌块B成二糖，然后将二糖激活成活化状态作为供体，继续与第三个单糖受体反应。如此反复延伸，直至得到目标寡糖。该策略包含非常多的保护基操作步骤，仅适用于简单线性寡糖的合成，且随着供体部分糖链的延长，其反应活性会逐渐降低，糖苷化产物的构型也会出现问题。为了提高寡糖线性合成的效率，探索寡糖合成的连续糖基化策略已成为一种趋势。

汇聚式合成（convergent synthesis）策略则引入了组合化学的思路，首先对目标寡糖进行逆合成分析，将其分成几个小的寡糖片段，这些小片段可以较方便地预先合成，然后对小片段进行组装获得大的目标寡糖。如图2-29所示，目标四糖ABCD可由AB和CD两个二糖片段组合而来，而两个二糖片段则可方便地预先单独合成。汇聚式合成在很多方面明显优于线性策略，大大减少了操作步骤，该方法已经被广泛应用于线性及分支复杂寡糖的合成。

双向合成（two-directional synthesis）策略则是以目标寡糖分子中间部位的某一单糖为出发点，使之即作为糖基受体也作为糖基供体，以之为中心分别向糖链两侧延长。杨劲松小组采用双向合成策略，以核心木糖硫苷为中心，“一锅法”合成了一个细菌胞壁四糖（图2-30）。

2.寡糖的“一锅法”合成策略

对于传统的分步法寡糖合成，路线往往很长，需要进行反复保护和脱保护操作，最终产物的总收率较低。整个合成过程往往耗时、耗力，大大降低了寡糖合成的效率，极大地限制了分步合成方法在大量合成中的应用。“一锅法”合成（onepot synthesis）策略是指将反应所需的糖基砌块按照一定顺序加入到同一反应容器中，待前一步糖苷化反应结束后再加入下一步反应的砌块，与前一步反应的产物进行偶联，如此反复进行，直至生成最终产物后进行纯化得到目标寡糖。在寡糖合成中应用这一策略，使多步偶联反应在同一反应容器中按一定顺序在较短的一段时间内完成，只在反应结束后进行一步纯化即可得到最终产物。“一锅法”的优势在于，不需要对反应中间体进行分离，也避免了对反应中间体实施保护基操作，从而使合成效率大为提高。“一锅法”寡糖合成是基于糖苷化反应供体或受体的反应活性差异来实现的，具体操作中可分为化学选择性合成策略、正交选择性合成策略和预活化策略。

（1）基于化学选择性的“一锅法”合成：

化学选择性合成（chemical selective synthesis）是通过保护基的调节来产生糖基砌块间反应活性的差异，因此，可以使用含有相同类型离去基团的糖基供体，并经历相同类型的糖苷化反应条件即可实现“一锅法”合成。保护基的电性效应对糖基反应活性的影响早有研究，醚类等富电子保护基倾向于促进糖基供体异头位基团的离去从而提高砌块的供体活性；酯类等吸电子保护基则倾向于降低异头位基团的离去活性，通过一定的保护基设计即可得到活性不同的糖砌块。如图2-31所示，在化学选择性“一锅法”合成中，应最先加入活性最高的砌块，使之作为目标寡糖的非还原端；然后依次加入活性次之和反应活性最低的供体砌块，最后加入反应体系中只能作为受体砌块的还原端砌块，通过串联的一锅反应得到目标寡糖（图2-31）。

翁啟惠小组发展的程序“一锅法”在这一方面做出了突出的贡献。他们合成了一系列不同保护基保护的硫苷供体或受体，然后测定了每个砌块的反应活性并用相对反应活性值（RRVs）加以标识。将RRVs录入“OptiMer”电脑程序，只需输入目标寡糖分子即可供出合成所需要的具有一定反应活性顺序的糖基硫苷砌块。如图2-32所示，肿瘤表面糖抗原Globo H六糖即可采用程序“一锅法”，按照RRVs值逐渐降低的砌块7、8、9的顺序成功合成。叶新山小组也利用化学选择性策略，“一锅法”成功合成了具有重要生物学意义的α-Gal五糖抗原，合成效率远远高于传统的分步合成法（图2-33）。

（2）基于正交选择性的“一锅法”合成：

正交选择性合成（orthogonal selective synthesis）策略中选择的是具有不同异头位离去基团的糖基砌块，从而通过采用不同的糖苷化反应条件，每次偶联反应中仅选择性地使一种供体活化而另一种相对稳定的砌块做受体。这就要求用于正交选择的糖砌块稳定性要好，仅在其相应的促进剂条件下才被活化发生反应，而在其他条件下稳定（图2-34）。正交选择性策略优于化学选择性合成之处在于，后者仅适用于合成砌块活性存在显著性差异的寡糖，且高活性砌块只能处于目标糖链的非还原端，而前者则可选择多种，且不需要在各砌块之间形成活性梯度，选用活性低的砌块做供体，用活性高的做受体。

第一个正交选择性“一锅法”合成是由Takahashi小组报道的，糖砌块之间的活化顺序差别是通过采用含有不同类型异头位离去基团的供体来实现的。这一策略既可用于线性寡糖的合成，也可用于分支糖，还被成功用于复杂寡糖的合成（图2-35）。

（3）寡糖合成的“一锅法”预活化策略：

寡糖合成的“一锅法”预活化合成（preactivationbased one-pot synthesis）策略中，在第一个糖基受体加入到反应体系中之前，先用促进剂将第一个糖基供体进行活化，加入受体后立即偶联获得一个异头位确定的二糖；然后再在加入下一个受体之前，将上一步获得的二糖供体活化，再加入第二个受体进行偶联，如此反复，直至获得目标产物（图2-36）。预活化策略明显优于上述两种策略，其既不需要糖基供体砌块间有足够大活性梯度差异，也不必要用不同的异头位供体类型。因此，用于该过程的糖砌块不需要进行复杂的保护基设计，路线设计非常灵活。

最早的预活化策略是由Vander Marel小组报道的，他们用二苯基亚砜/三氟甲磺酸酐（Ph2SO/Tf2O）促进剂体系成功合成了α-Gal抗原表位。后来，叶新山和黄雪飞小组又对方法进行了改进，合成了一系列复杂寡糖（图2-37）。

3.寡糖的自动固相合成

固相合成（solid-phase synthesis）在多肽和核酸合成中的成功应用，使得糖化学家们开始考虑用固相合成的方法解决糖合成中遇到的困难。与传统的液相合成相比，固相合成具有两方面显著优势：一方面，固相合成使分离纯化过程大大简化，在固相合成中，反应在固相载体上完成后只需要进行简单的洗涤即可除掉过量的反应试剂，避免了液相合成中反复多步柱层析操作，大大提高了寡糖合成效率；另一方面，由于反应的流动性和纯化的便捷性，固相合成中可以使用大大过量的反应试剂或反应物，从而使得反应收率得以提高。此外，在固相合成仪的帮助下，固相合成还可以实现自动化，这就为寡糖的自动合成提供了新的思路（图2-38）。

（1）固相合成中的载体和连接桥：

固相合成（solid-phase synthesis），顾名思义就是在固相载体上进行糖苷化反应。因此，固相合成大体上分为两种策略：一种是载体与糖基供体相连，就是将目标糖链非还原末端的单糖供体连接在聚合物载体上，从而使糖基供体被固定，一步步从非还原端向还原端延伸；另一种是载体与受体相连，它是将目标糖链还原末端的单糖砌块作为受体连接在聚合物载体上，从而使糖基受体被固定，合成过程从还原端向非还原端延伸。若第一个固定在载体上的糖砌块既可作供体又可作受体，就变成了双向糖基化。

用于固相合成的聚合物载体和连接桥应为惰性材料，在合成过程中应保持足够的稳定性，但是在特定条件下能够释放产物糖片段，以便于在需要时可将产物从载体上顺利切下。常用的固相载体分为不溶性载体和可溶性载体，其中可溶性载体兼有液相合成和固相合成的优点，它能使所有的反应都在均相中进行。图2-39列出了几中常见的不溶性载体聚合物，其中最常用的是Merrifield树脂。

固相合成中连接桥（spacer linker）的选择也很重要，常用的连接桥包括硅醚类、硫苷类连接桥、对酸和碱敏感的连接桥以及可氧化、氢化或光照断裂的连接桥等。不同连接桥需要在不同条件下断开，合成过程中糖上保护基的选择也要避开与连接桥的相互影响。

（2）寡糖固相合成实例：

第一篇关于固相合成的报道是1971年发表的。近年来Seeberger小组在寡糖的固相合成方面做了大量工作，并用固相合成仪实现了寡糖的固相自动合成。采用载体与受体相连的策略，以氯甲基化聚苯乙烯树脂为载体，辛烯二醇为连接桥，并借助寡糖固相合成仪，以远远超过传统合成的收率成功合成了细菌胞壁三糖和十二糖（图2-40）。此外，Lewis X、Lewis Y相关寡糖以及Globo H也已采用上述策略成功合成。

（3）寡糖自动固相合成中存在的问题：

目前，寡糖的自动固相合成仍存在一些问题，其应用范围也有待扩展。首先，固相合成中往往需要加入大量的试剂或者糖基砌块以达到满意的收率，造成了资源浪费，加大了工作量。每步糖苷化反应所生成产物结构，尤其是立体构型的在线监测仍难以实现，通常只能等到最终产物切下之后对整个分子进行结构确证，而无法及时纠正反应过程中的问题。而且，最终产物从连接桥上切下后，其还原端的结构往往不能直接应用，还要经过官能团转换。此外，目前寡糖的固相合成仪还未实现商品化，仅在少数实验室中使用，且目前的固相合成仪在温度控制方面尚无法满足很多糖苷化反应所需要的低温。

二、酶合成法

虽然糖化学家们已经发展了大量的寡糖化学合成方法和策略，但复杂寡糖的合成仍然是一项烦琐复杂、费时费力且只有专业糖化学人士才能完成的工作。糖合成路线往往步骤冗长，保护基操作繁多。即便如此，化学糖苷化产物的区域选择性和立体选择性也不能得到保证。近年来，酶促寡糖合成法也像化学糖合成法一样，作为糖合成的一部分为合成化学家们所接受，并与化学法联用实现了很多复杂寡糖分子的高效合成。酶法寡糖合成（enzymatic oligosaccharide synthesis）是基于酶催化的专一性和高效性，不需任何保护基操作，直接以裸露的糖为底物，仅经过一步酶促反应即可获得具有良好区域选择性和立体选择性的糖苷化产物。整个反应以水为溶剂，避免了有机溶剂的使用。酶法寡糖合成因其高效性和专一性，能够实现寡糖和糖缀合物的大量制备。随着生物工程技术的发展，糖合成相关酶得到了不断改造，其合成效率得到提高，应用范围也得以扩大。在早期研究中，酶仅用于化学法效果不佳或成本较高的反应步骤。随着酶研究的深入和酶来源的丰富，科学家们已开始探索将多种酶组合体系用于寡糖合成，每个反应步骤只单独应用一组酶称为“一锅多酶”连续糖苷化（one-pot multienzyme sequential glycosylation）法，这种策略已成功合成了许多复杂寡糖和糖缀合物，如明星分子唾液酸化路易斯X抗原（SLeX）的大规模制备、唾液酸化的核心岩藻糖化的分化簇52（CD52）糖链的成功合成等。

然而，酶法合成目前仍受到酶来源的限制，尤其是哺乳动物来源的酶，往往表达量很低，底物适应范围窄，且使用过程中十分脆弱，容易失活。此外，酶反应体系往往很复杂，有些底物适应性差、反应收率低的酶催化的反应往往难以改善。但相信，随着基因工程和蛋白质工程的发展，这些因素将逐步被克服。有科学家认为，酶促合成应该是实现寡糖快速、大量、低成本合成甚至自动化合成的最有希望的途径之一。目前用于寡糖合成中的酶主要有糖基转移酶、糖苷酶和糖合成酶三类，以下分别进行介绍。

（一）糖基转移酶

自然界中的糖基转移酶（glycosyltransferase）分为Leloir转移酶和非Leloir转移酶，两者的区别在于所利用的糖基供体不同。Leloir转移酶（Leloir glycosyltransferase）利用的糖基供体是核苷酸活化的单磷酸或者二磷酸化糖苷，而非 Leloir转移酶（non-Leloir glycosyltransferase）利用的供体则是异头位磷酸化的糖苷。酶促寡糖合成中应用的主要是Leloir转移酶，而非Leloir转移酶应用较少。

在糖基转移酶催化的寡糖合成中，糖基转移酶将核苷酸活化的糖基供体（NDP-sugar）的单糖单元转移到合适的糖基受体上，而获得目标寡糖（图2-41A）。该酶促反应过程一般具有严格的区域选择性和立体选择性，根据糖基转移酶催化机制的不同，新生成糖苷键的立体构型可以与供体单糖（NDP-sugar）的构型一致，也可能发生反转。不同糖基转移酶所利用的核苷酸活化的糖基供体的种类不同，葡糖基转移酶、乙酰氨基葡萄糖基转移酶、葡糖醛酸基转移酶、半乳糖基转移酶和乙酰氨基半乳糖基转移酶利用的供体糖苷为尿苷二磷酸酯衍生物尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glc）、尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-Glc-NAc）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDP-GlcUA）、尿苷二磷酸半乳糖（UDP-Gal）和尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖（UDP-GalNAc）；岩藻糖基转移酶和甘露糖基转移酶需要以糖基鸟苷二磷酸酯活化的糖苷鸟苷二磷酸岩藻糖（GDP-Fuc）和鸟苷二磷酸甘露糖（GDP-Man）为供体；唾液酸基转移酶则利用糖基胞苷单磷酸酯胞苷单磷酸唾液酸尿苷二磷酸葡萄糖（CMPNeu5Ac）。需要注意的是，这些核苷活化的糖基供体都价格昂贵，目前仅UDP-Glc可以大量地从商业来源购买。从图2-41可以看出，该反应在得到目标寡糖的同时还获得了糖基供体水解副产物NDP，而后者通常是相应糖基转移酶的抑制剂，需要及时从反应体系中除去以便获得良好的反应收率。因此，在后来的发展中又在反应体系中加入了磷酸酶（phosphatase）用以将NDP水解为无机磷酸盐（图2-41A）。此外，翁啟惠小组用多酶体系构建了糖核苷酸合成的再生体系，该体系可以将NDP副产物重新利用生成新的NDP-sugar糖基供体（图2-41B）。

糖基转移酶是目前自然界中存在最为多样的一大类酶，关于其合成基因及合成途径、结构与功能的关系已有相当深入的研究。目前已经发现的糖基转移酶有数百种，有很多已成功用于多种复杂寡糖的高效合成，如：1，4-半乳糖基转移酶（1，4-GalT）用于细菌寡糖的合成（图2-42）；1，4-甘露糖基转移酶（1，4-ManT）可将甘露糖以1，4糖苷键成功转移到了磷酸酯化的壳二糖受体上，用于构建化学合成较难获得的β甘露糖苷键（图2-43）；2，3-唾液酸基转移酶（2，3-SiaT）能容易地引入化学合成中极具挑战性的α唾液酸糖苷键。翁啟惠小组利用α2，3-SiaT、α1，3-岩藻糖基转移酶（α1，3-FucT）两种糖基转移酶和相应的两种糖基供体胞苷单磷酸唾液酸（CMP-Neu5Ac）、鸟苷二磷酸岩藻糖（GDP-Fuc），成功合成了唾液酸化的Lewis X十糖（图2-44）。

（二）糖苷酶

生物体内的糖苷酶（glycosidase）的功能是降解糖链及其缀合物。按照作用位点和方式不同，生物体内的糖苷酶可分为外切糖苷酶（exo-glycosidase）和内切糖苷酶（endoglycosidase）两种。外切糖苷酶是从糖链的非还原末端开始对其进行切割，每次仅识别一个单糖单元，偶尔是一个二糖单元；内切酶则能够从寡糖链或其缀合物内部的糖苷键开始水解。目前对外切糖苷酶的研究较多。

然而在体外，通过对反应条件的控制，糖苷酶却能够表现出合成糖苷键的活性。目前糖苷酶体外用于寡糖合成主要通过两种途径，一种是热力学控制的逆水解反应途径，另一种是转糖基反应途径，受动力学条件控制。在逆水解反应过程中，糖苷酶可以直接以不经任何修饰的游离糖为底物，将糖基供体与受体羟基直接缩合，水作为离去基团离去。但是，此反应往往收率很低，因此实际应用中使用较多的是转糖基反应途径。该过程中，糖基供体往往需要用特定基团对异头位进行活化，糖苷酶再将这种活化了的供体与受体缩合成苷（图2-45）。

与糖基转移酶相比，糖苷酶较易大量获得，酶的稳定性好、易于操作，能够直接以未修饰或简单修饰的糖为供体，不需要昂贵的核苷活化的供体，底物容易获得，工业上已经有若干大量应用。但是，虽然糖苷酶对糖的端基构型的选择性通常是严格、绝对的，对于苷元结构的区域选择性却较低，因此反应产物通常是混合物。也正因为如此，糖苷酶往往对带有肽段和脂的底物具有较好的适应性。目前，糖苷酶是酶法获得均一糖蛋白和神经节苷脂相关糖脂的唯一途径。α1，3-岩藻糖苷酶及多种半乳糖苷酶已经成功用于多种寡糖的合成，图2-46所示的是王来曦小组采用两种外切糖苷酶组合合成分支六糖修饰的糖蛋白的过程。

（三）糖合成酶

自然界中存在的用于糖链合成的糖基转移酶和糖苷酶在用于实际糖链合成时往往存在着很多的弊端，如上述的糖苷酶在应用时就存在反应收率过低的问题。其原因是由于糖苷酶潜在的糖苷键水解活性，使得合成反应其实是一个糖苷键水解与合成的失衡，从而大大限制了很多糖苷酶的推广应用。糖合成酶（glycosynthase）是利用基因工程和蛋白质工程对现有的糖苷酶进行改造，以规避实际合成中现有的问题，优化酶的底物适应性、反应活性和稳定性等而获得的仅能催化糖苷键合成的人工酶。

糖合成酶是通过基因工程手段，对糖苷酶催化中心的氨基酸残基位点进行定点突变改进而来的一种糖基转移活性大大提高了的全新的人工酶。第一个糖合成酶是由Withers小组在对一种β葡糖苷酶进行分子改造时发现的，该酶在经过氨基酸残基定点突变后失去了天然糖苷酶的糖苷键水解活性，仅有糖链合成的活性。后来又有多种成功改造的糖苷酶的例子，目前β甘露糖合成酶、α葡糖合成酶及相应的硫苷合成酶都已有报道。

除了直接参与糖苷键合成的上述三大类酶之外，还有糖激酶、硫酸基转移酶等与糖苷键生成无关的酶。这些酶往往用于酶法合成中糖基供体的制备以及寡糖后期的特殊修饰。

（四）化学酶合成法

化学糖苷化具有极大的灵活性，不仅适用于天然糖链结构的合成，同时还可以应用于非天然糖链的合成。然而除了糖链化学合成固有的反应步骤繁多、费时、费力，需要经过专业训练的人士才能完成外，其对于一些具有挑战性的糖苷键的构建还是效率很低，比如唾液酸糖苷、岩藻糖糖苷的合成等。因此，将化学合成的灵活性与酶法合成的高效性结合起来，采用化学酶法合成（chemoenzymatic synthesis）策略是实现复杂糖链分子的一条高效途径。

化学酶法合成有两种形式，一种是将酶法合成得到的产物作为关键中间体应用于化学合成结构更为复杂的糖链分子（酶法合成→化学合成）。如图2-47所示，以半乳糖硫苷为受体，乙酰氨基甘露糖（ManNAc）为唾液酸糖基供体的前体，在“一锅三酶”催化体系下一步就可以得到二糖唾液酸糖苷，这一二糖砌块经保护基操作作为糖基供体被应用于化学合成唾液酸化的Lewis X（SLeX）抗原。化学酶法合成的另一种形式是以化学合成得到的糖链为底物，在糖基转移酶的催化下酶法合成结构更为复杂的糖链（化学合成→酶法合成）。如图2-48所示，在翁啟惠小组报道的唾液酸化的Lewis X二聚体的合成中，该小组先化学合成了乳糖胺二聚体的四糖，然后以该化学合成的四糖为底物先用酶法将唾液酸基引入非还原末端形成2，3-连接的唾液酸，然后再通过酶法将两个岩藻糖基同时引入形成两个1，3-连接的岩藻糖。

最近姚文龙等在合成唾液酸化新人乳四糖（LSTa）的过程中将糖链的化学合成与酶法合成进一步的融合，先将酶法合成得到的产物作为中间体应用于化学合成，再将化学合成得到的糖链经酶法合成进行进一步的延伸（酶法合成→化学合成→酶法合成），实现了该复杂五糖的合成（图2-49）。

虽然通过糖合成途径获得糖药物困难重重，但仍有不少成功的范例。比如已经上市的托吡酯、扎那米韦、伏格列波糖、磺达肝素等就是全合成或半合成的糖类药物。在研的多种糖疫苗糖链的合成也是目前糖合成研究的热点。糖合成是未来糖类药物发展中最具挑战性也是潜力最大的方向之一，相信不久的将来糖合成的突破必将极大地推动糖类药物的发展。