第四章　标记免疫检验

答：免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即应用制备好的特异抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。它的特点是具有高度的特异性和灵敏度。如将试剂中的抗原或抗体用可以微量检测的标记物（例如放射性核素、荧光素、酶等）进行标记，则与标本中相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物；通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的灵敏度，实现了对于微量生物活性物质的测定。目前，临床免疫学检验已离不开标记免疫技术的应用，主要包括荧光免疫分析、放射免疫分析、酶免疫分析和化学发光免疫分析等。这些免疫学技术方法准确可靠，操作简便、易于商品化和自动化，适用范围广，是目前临床免疫检测中最常采用的技术，满足了临床诊疗的需求。

答：以免疫沉淀和免疫凝集反应为基础的经典免疫学技术，其检测灵敏度低，很难实现定量检测，特别是在临床病原体感染诊断和体内微量生物活性物质的测定中有很大的局限性。随着现代免疫学技术的发展及各种自动化仪器的产生，特别是标记免疫学分析技术的应用逐渐克服了各种检测局限性，实现了微量物质的检测。例如：1960年高灵敏度放射免疫测定技术的问世，解决了微量生物活性物质临床难以检测的问题；20世纪60年代末，以酶标记技术发展起来的酶联免疫吸附测定方法可广泛应用于临床对病原体抗原、抗体的检测。20世纪90年代，各种自动化免疫分析仪器不断进入临床检验，给实验室日常工作带来了极大便利，而且其测定较之人工操作更为稳定和准确。这种抗原抗体特异性结合并充分利用生物标记的免疫技术，已成为我们认识和检测未知物质的一种难以替代的手段；标记物、单克隆抗体、固相支持物等的发现与应用，使免疫学技术得以创新改进，并不断派生出许多新的检测技术方法，因此其成为现代免疫学的核心技术。

答：在标记免疫测定中，最常用的标记物有放射性核素、酶、荧光素、化学发光剂和胶体金等。主要结合原理如下：①放射性核素的标记最常用的是氯胺T标记法；氯胺T在水溶液中分解生成具有氧化性的次氯酸，可以将 ¹²⁵ I ^-氧化生成 ¹²⁵ I ⁺，后者具有一价正电荷，可取代被标记物分子中酪氨酸残基苯环上的氢原子，从而使被标记物标记上 ¹²⁵ I，最后向溶液中加入还原剂偏重亚硫酸钠即可终止标记反应。②酶与抗原或抗体的结合通常采用戊二醛交联法，戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。③荧光素抗体的标记方法采用搅拌法和透析法。以异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记为例，在碱性溶液中，FITC的异硫氰基能与抗体蛋白的自由氨基形成硫碳酰胺键，进而结合在抗体上。④化学发光剂的标记是通过化学反应将发光剂连接到抗原或抗体上，按照标记反应的类型及形成结合物的特点，可将标记反应分为 “直接偶联”和 “间接偶联”两种方式；直接偶联是通过偶联反应，使标记物分子中反应基团直接连接到被标记物分子的反应基团上，如碳二亚胺缩合法、过碘酸钠氧化法、重氮盐偶联法等；间接偶联法使用功能交联剂在标记物分子和被标记物分子之间插入一条链或一个基团，使两种物质通过引进的 “桥联基团”连接成结合物，此法应用范围广，如琥珀酰亚胺活化法。

答：标记反应完成后，反应产物的质量直接关系到免疫技术检测最终的定性、定位和定量结果。由于反应溶液中除含有标记物，还含有未被有效标记的被标记物分子及其聚合物、未结合的抗原或抗体等，其中未被有效标记的被标记物分子及其聚合物会造成非特异性显色，游离的抗原或抗体对免疫测定反应有干扰，因此，标记反应后需要对反应产物进行纯化。纯化的方法较多，根据所采用被标记物性质的不同而异，纯化的方法有利用分子筛机制的凝胶过滤法、利用分子极性差异进行吸附-解离的离子交换层析法、按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁徙速率不同进行分离纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳法（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography， HPLC）等。

答：标记产物纯化后需要对其纯度和活性作鉴定，以确定其是否达到所需的性能参数，标记物的鉴定包括化学纯度和免疫活性。

是指结合于抗原或抗体上的标记物活性占总标记物活性的百分比，通常要求大于95%。一般情况下，被标记物（抗原或抗体）的纯度、标记后纯化效果均会影响化学纯度。常用的测定方法是利用三氯乙酸将待测样品中所有蛋白质沉淀，离心后测定沉淀物（标记物）的纯度并计算其待测样品总化学纯度的百分比。

指标记产物与相应抗体或抗原反应的能力，反映标记过程中被标记物免疫活性受损情况。检测免疫活性的方法是取少量标记抗原（或抗体）与过量抗体（或抗原）反应，测定结合部分的强度，计算其与加入的标记物总强度的百分比；一般要求大于80%，值越大说明免疫活性受损越小；如果值过小，提示标记物免疫活性受损严重，需要重新制备。