第五章　细胞外基质与疾病

人体的各种组织由数目众多的细胞和细胞外大量生物大分子组成，后者由邻近细胞合成与分泌，它们通过与细胞及自身相互作用形成错综复杂的网络结构组成了细胞外微环境，调控和维持细胞的稳态。这些分子我们称之为细胞外基质（extracellular matrix，ECM），主要包括了多种蛋白质和多聚糖（polysaccharides）。基质蛋白（matrix proteins）是参与组成细胞外基质的主要成分，可调控同样存在于细胞外基质中各种生长因子（growth factors）的活性以及生长因子与其特异性受体的亲和力，同时可与多种细胞膜上重要的信号传导受体如整合素（integrin）特异性结合，调控包括细胞识别、分化、黏附、增殖、迁移、衰老、凋亡等在内的诸多生物学行为。此外，细胞外基质还存在可降解基质蛋白并调控其含量与活性的细胞外蛋白酶（extracellular proteinases）。生理情况下，基质蛋白、生长因子和细胞外蛋白酶通过相互作用构成了广义的细胞外基质网络，维持细胞的正常形态与功能。然而细胞外基质由于组成多样、相互作用又呈复杂的动态变化，在疾病状况下表现为网络调控的异常，影响到基质的支撑、巢穴、屏障、信息汇聚和传递功能，从而引起细胞表型和组织结构的改变，导致细胞形态和功能的病理损伤，最终引起各种人类重大疾病如发育异常、肿瘤、心血管及代谢性疾病等。因此，细胞外基质异常是多种人类重大疾病发生和发展的一个重要病理生理基础，这为诊断和防治疾病，抑或研发新药提供了重要靶点与目标。

组成细胞外基质的大分子主要由局部细胞产生分泌，如结缔组织的基质成分主要由成纤维细胞（fibroblast）分泌，而在软骨或骨组织中的细胞外基质成分则分别主要由成软骨细胞（chondroblast）或成骨细胞（osteoblast）产生。

基质蛋白是组成细胞外基质的主要结构成分，其分为：①包含胶原蛋白家族和弹力蛋白的纤维蛋白（fibrous proteins）；②由 糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）与蛋白质共价结合形成的蛋白聚糖（proteoglycan，PG）；③包含天冬氨酸寡糖化的非胶原糖蛋白（glycoprotein，GP）。目前已知哺乳动物有近300种基质蛋白，包括约40种胶原蛋白，约 36种蛋白聚糖以及200多种糖蛋白。

细胞外基质中的纤维蛋白主要包括胶原蛋白（collagen）和弹力蛋白（elastin），它们通过交联聚合共同构成了结缔组织中的纤维成分，稳固了细胞外基质的结构。

胶原（collagen）是细胞外基质中含量最高、抗张强度最大的骨架结构，可由成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞及某些上皮细胞等合成并分泌到细胞外。目前已经发现了至少19种胶原。胶原的基本单位是由Gly-X-Y重复顺序构成的L-α-螺旋（α链），其中 X常为 Pro（脯氨酸），Y 常为羟脯氨酸或羟赖氨酸残基。胶原分子是由三条α链构成的三股螺旋（胶原域），三股胶原分子再相互盘绕成右手超螺旋，构成原胶原。α链富含的羟脯氨酸和羟赖氨酸具有协调稳定三股螺旋构型的重要作用。脯氨酸及赖氨酸残基的羟基化修饰发生在粗面内质网合成α链后，三股螺旋形成之前。其中脯氨酸残基的羟化反应是在与膜结合的脯氨酰-4羟化酶及脯氨酰-3羟化酶的催化下进行的。维生素C是这两种酶所必需的辅助因子，维生素C的缺乏导致胶原的羟化反应不能充分进行，不能形成正常的胶原纤维，最终引起非羟化的前α链在细胞内被降解。因而，膳食中缺乏维生素C可导致血管、肌腱、皮肤变脆，易出血，称为坏血病。

胶原按其功能分为两类。第一类是成纤维胶原，其胶原域由长而不中断的三股螺旋组成，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ型，广泛分布于细胞外基质中。其中Ⅰ、Ⅲ型分布于疏松结缔组织中，Ⅱ型分布在软骨组织中。第二类是非纤维胶原，其胶原域中的三股螺旋是不连续的，它们可分为：①网架结构性胶原，包括Ⅳ型（基底膜型）、Ⅷ型和Ⅹ型；②微丝结构性胶原，即Ⅳ型胶原；③纤维连接胶原，自身不形成纤维，但能与ECM中的纤维相连，包括Ⅸ、Ⅻ、ⅩⅣ、Ⅹ、Ⅵ、ⅩⅨ型；④锚定作用的微丝，即Ⅶ型胶原；⑤跨膜胶原，即ⅩⅦ型胶原。

弹力蛋白（elastin）是弹性纤维的主要成分，是保持组织器官诸如肺、皮肤和血管等具有弹性特征的主要蛋白。弹力蛋白为高度疏水性的蛋白质，分子通过赖氨酸残基间相互交联形成富有弹性的网状结构。弹力蛋白的合成主要集中在胚胎时期以及出生后的一段时间内，而成年动物体内，只有极少量的弹力蛋白合成。但在一些病理情况下，弹力蛋白合成显著增加。比如在高血压的时候，弹力蛋白合成增加并介导了血管机械应力的增强。此外，在某些病理情况下会导致基质蛋白酶表达增加或活性增强进而降解弹力蛋白，使其含量显著下降，如动脉瘤中，活性上调的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）降解弹力蛋白，使血管壁弹性下降，膨出形成瘤体。

蛋白聚糖（proteoglycan，PG）在细胞外基质中以水样或凝胶样的物质形态存在，被纤维蛋白或糖蛋白所包裹。蛋白聚糖的存在使基质具有一定的抗压性，并且保证了营养物质、代谢产物及信号分子在基质中的快速弥散和传递。

蛋白聚糖由一个核心蛋白分子和一个或多个糖胺聚糖的侧链共价结合而成。不同蛋白聚糖不仅核心蛋白结构不同，其结合的糖胺聚糖类型和大小也不同 （表5-1）。　糖 胺 聚 糖 （glycosaminoglycan，GAG）是指含有高电荷的多糖类化合物，包括硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素和透明质酸。它们的基本单位是由一个己糖和一个己糖胺构成的双糖重复序列。双糖键以及硫酸化的位置不同，导致了这些氨基聚糖链的结构不同，其中透明质酸是蛋白聚糖中唯一不发生硫酸化的蛋白质。

蛋白聚糖能结合大量的水分，使组织具有弹性，具有缓冲碰撞和挤压的能力。此外，它们还能与多种细胞生长因子及其受体选择性结合，参与调节细胞因子的浓度以及细胞内的信号转导。如基底膜蛋白聚糖（perlecan）有5个结构域，能结合血小板衍生生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）家族成员等生长因子以及肝素、胶原、多种非胶原糖蛋白、整合素等。

非胶原糖蛋白（non-collagen glycoprotein）构成了细胞黏附、迁移及分化的主要基质结构，这类糖蛋白一般含有与细胞黏附分子结合的位点，其中典型的三肽Arg-Gly-Asp（RGD）序列，能被细胞膜上的整合素家族所识别。非胶原糖蛋白包括纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、层粘连蛋白（laminin，LN）、玻连蛋白（vitronectin）、血小板反应蛋白（thrombospondin，TSP）、内皮粘连蛋白（entactin/nidogen，EN）、波浪蛋白（undulin，UN）、生腱蛋白（tenascin）、骨相关的基质糖蛋白和von Willebrand因子等。它们的转录产物由于剪切加工的不同，产生一系列结构与功能十分相似的蛋白质，组成了一个蛋白质家族。

纤维连接蛋白具有肝素和纤维蛋白原结合区、胶原结合区以及含有RGD序列的整合素结合区。在人体已鉴定的纤维连接蛋白亚单位有20种以上，它们都是由同一基因编码的产物。转录后由于拼接上的不同形成多种异型分子。纤维连接蛋白分为血浆型和细胞型。前者主要来源于肝细胞，少量来源于血管内皮细胞，是两个亚单位借助其C端两个二硫键交联形成的V形二聚体；后者为多聚体，以不溶解的形式存在于细胞外基质和细胞表面。

现已发现7种层粘连蛋白分子，8 种亚单位（α 1、α 2、α 3、β1、β2、β3、γ1、γ 2），每种亚单位由不同的基因编码。层粘连蛋白是迄今所知糖链结构最复杂的糖蛋白，具有 50条左右N连接的糖链，可被层粘连蛋白的多种受体识别与结合。层粘连蛋白分子是由A、B ₁和B ₂三条肽链形成的异三聚体，三条肽链中都具有表皮生长因子（EGF）样重复序列，三聚体形状犹如十字架，在组织中装配成丝，并与Ⅳ型胶原一起，构成基底膜中的片层网状结构。基底膜（basal laminae）除由层粘连蛋白和Ⅳ型胶原组成外，还需有内皮粘连蛋白和基质膜蛋白聚糖一起参与形成完整的结构。

TSPs是一类基质细胞蛋白（matricellular proteins），该家族有 5个成员，被分为两类：第一类包含 TSP-1、TSP-2和 TSP-3，通过氨基端聚合成三聚体形式存在；第二类包括TSP-4和TSP-5，通过氨基端聚合形成五聚体。TSPs在多种细胞组织中都有表达，目前已知其功能与软骨发育、血小板活化、血管重塑及心脏功能调节密切相关。

包括骨桥蛋白（osteopontin）、骨连蛋白（osteonectin）和骨钙蛋白（osteocalcin），因含有较多的酸性氨基酸而带有负电荷。它们除了在骨组织中表达，与骨的发育、重建、代谢有关外，还具有广泛的组织细胞分布特性，在细胞的黏附、移行及肿瘤转移中发挥作用。

整合素是基质蛋白重要的细胞膜受体分子，属于细胞黏附分子中的一大家族。

整合素（integrin）是由α和β亚基以非共价键结合形成的异二聚体，它们与配体的结合依赖二价阳离子。整合素与配体的关系比较复杂，一种整合素可结合多种配体，而一种配体也可结合多种整合素。这种多位点的结合除了有利于黏附的稳定外，也与整合素的复杂功能有关。目前已发现18种α亚基和9种β亚基，它们可相互结合形成20多种整合素（图5-1）。整合素家族又可分为数个亚族，迄今了解最多的有三个亚族，每个亚族由一个共同的β亚基和一组特定的α亚基组成。两种亚基都有一个较大的球形的细胞外区、一个跨膜区和一个较短的细胞内区。其细胞外区为配体结合区，有3～4个二价阳离子结合位点。胞质区通过包括α-辅肌动蛋白、踝蛋白、黏着斑蛋白、桩蛋白（paxillin）和张力蛋白（tensin）在内的肌动蛋白结合蛋白（actin binding protein，ABP）与骨架蛋白中的肌动蛋白细丝连接。整合素和配体结合过程中，经历了一个动态性的变化，包括亚基的相对移动和功能域内的构象变化。整合素对其配体呈现多种不同亲和力的状态，这些状态能被细胞外因素（如二价阳离子）和细胞外信号引发的细胞内信号转导通路成分所调节。在β ₁和β ₂亚基胞质区的C端以及桩蛋白、张力蛋白等细胞骨架结合蛋白中有酪氨酸磷酸化位点，它们是细胞内PTK的作用部位。现已证明生长因子、细胞因子等胞外信号启动的细胞信号转导通路，能激活细胞内酪氨酸蛋白激酶，使整合素胞内区的酪氨酸残基磷酸化，促进其与细胞内骨架蛋白的连接，导致整合素的聚集，从而提高了整合素与配体结合的亲和力，该过程被称之为整合素的活化。此外，由PKC催化的整合素胞内区及ABP的丝/苏氨酸残基的磷酸化可使整合素与胞外基质的亲和力下降，黏着斑蛋白被磷酸化后能快速地从黏附接触部分消失，表现为负调节作用。

目前已发现9种属于β1亚族的黏附分子，它们都具有共同的β ₁亚单位，但α亚单位各不相同。也称为VLA（very late antigen）亚族。它们分布广泛，主要介导细胞与细胞外基质成分的结合，因此被认为是细胞外基质的受体。现已证明当整合素α亚基与细胞外基质结合后，便聚集成簇，导致细胞骨架的重新组合，在细胞的多处组装形成黏着斑（focal adhesion，FA）以及与细胞长轴平行的应力纤维。黏着斑是整合素细胞内区有序聚集的一系列蛋白总称，如肌动蛋白结合蛋白（ABP）、骨架蛋白以及多种信号转导蛋白组成的复合物结构，类似于联系细胞外基质与细胞骨架的“铆钉”。此外，该家族的黏附分子还参与细胞间的黏附，包括介导淋巴细胞的归巢以及白细胞与激活的血管内皮细胞间的黏附反应。

该亚族有三个成员，即α _Lβ2或 CD11a/CD18（LFA-1）、α _Mβ ₂ 或 CD11b/CD18（Mac-1）和α _Xβ ₂ 或 CD11c/CD18（GP150/95），它们存在于各种白细胞表面，故也称为白细胞黏附分子。如α _Lβ ₂的配基是属于免疫球蛋白超家族的细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM）-1和2，它参与白细胞之间以及白细胞与内皮细胞之间的黏附。由于β ₂（CD18）亚基的基因突变而导致该亚基质或量的异常，可引起该亚族三种黏附分子组装障碍，造成白细胞黏附缺陷（leukocyte adhesion deficiency，LAD）综合征。LAD是一种遗传病，患者白细胞的黏附、趋化游走、吞噬及释放功能均发生障碍，重症患儿常因反复发作的严重细菌和真菌感染而在2岁前死亡。

该亚族主要存在于血小板表面，包括α _Ⅱbβ ₃和α _Vβ ₃，可与纤维蛋白原、纤维连接蛋白、玻连蛋白、血小板反应蛋白和von Willebrand因子等结合，介导血小板之间的聚集及血小板与基底膜的黏附，参与血栓形成。α _Ⅱbβ ₃或血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）是血小板中含量最丰富的跨膜糖蛋白，其胞外区具有两种可转化的构象形式。当血小板被凝血酶、胶原或其他血小板活化剂激活后，伴随 G蛋白的激活，细胞内 pH升高，Ca ²⁺浓度增高，磷酸肌醇代谢改变以及蛋白激酶的活化等血小板内信号转导的改变，GPⅡb/Ⅲa转为活化的形式，与配体纤维蛋白原结合的亲和力增高。血小板通过纤维蛋白原的桥联作用发生聚集反应。当血小板GPⅡb/Ⅲa的表达量减少或结构异常时可致血小板功能不全症，又称Granzamann血小板无力症。

近年来研究表明，多种黏附分子与其配体结合后都能触发跨膜信号转导，调节基因的表达，对细胞的表型和功能（细胞的增殖、分化、迁移等）产生明显的影响。目前研究最深入的是整合素与细胞外基质结合启动细胞内信号转导通路。整合素与细胞外基质结合导致整合素的聚集和黏着斑形成，并激活黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）等蛋白激酶，启动整合素介导的信号转导通路。FAK的N端和C端分别与整合素β亚基的胞内区以及ABP蛋白（如踝蛋白和磷酸化的桩蛋白）结合。激活的FAK首先发生自身磷酸化，也可被Src家族成员磷酸化，产生的磷酸化位点（pY）能与含SH2区的胞内信号转导蛋白或酶结合，激活Grb2/Ash-Sos-Ras-raf-ERK通路，应激激活的JNK通路，PLC-PKC通路，Ca ²⁺的信号转导通路和PI3K通路等（图5-2）；整合素与细胞外基质结合还能激活小 G蛋白 Rho、Rac和CDC42等的信号转导通路，调节肌动蛋白丝和应力纤维的形成。整合素与配体结合引发的信号通路可调节基因表达以及细胞骨架的组装和收缩，对细胞的表型和功能产生明显的影响。由细胞外基质-整合素-细胞骨架组成的结构能感受机械的（如切应力和机械牵拉）或细胞运动的刺激，如将心肌细胞培养在一种硅胶膜上，牵拉膜使心肌细胞伸展，可发现细胞内多条信号转导通路激活，并伴有细胞内RNA和蛋白质合成的增多，表明适当的机械刺激可以通过细胞外基质和整合素介导促进细胞的生长、分化和功能的维持。

基质蛋白组成的复杂网络为组织细胞提供了黏附与迁移的附着结构，对于维持组织结构的稳定起到了根本的保障作用。另外，基质蛋白还可影响细胞的信号传递，细胞分泌信号分子作用于邻近细胞是细胞间的信号传递重要方式之一。信号分子被分泌到胞外，在组织间液中扩散，在其作用于靶点的过程中，不可避免地与胞外基质蛋白网络结构发生相互作用，而基质蛋白所携带的高密度负电荷及各自的蛋白相互结合结构域可与分泌的信号蛋白发生相互作用，因此改变信号蛋白的作用及下游信号通路。

蛋白聚糖所包含的硫酸乙酰肝素侧链具有较高的负电荷，可与大量分泌信号分子结合，如促进细胞增殖的成纤维细胞生长因子（FGF）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）。因此，蛋白聚糖通过其结构上的生长因子结合位点限制了生长因子的扩散并将其作用限定在邻近细胞局部，蛋白聚糖可被视作这些生长因子的“局部储存容器”。此外，蛋白聚糖在胚胎发育过程中形成的局部生长因子浓度梯度对于组织结构形态发生具有重要的意义。蛋白聚糖还能通过募集生长因子（如FGF），使其发生寡聚化，增加其结合受体与活化下游信号的能力。

糖蛋白结构上具有大量可与其他蛋白结合的结构域，通过与胞外分泌的生长因子结合，可增强或抑制生长因子的活性及下游信号通路。纤维连接蛋白的Ⅲ型重复序列可与VEGF结合，另一结构域可与肝细胞生长因子（HGF）结合，从而促进这些因子的生物学活性。软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）可与 BMP2结合，抑制其与细胞膜受体结合，从而抑制其下游信号。

基质蛋白不仅仅是结构蛋白，同时还可作为旁分泌信号分子，类似细胞因子、生长因子和激素，调控细胞的功能。一部分基质蛋白天然构象对细胞无影响，只有翻译后修饰暴露出特定结构域后才会对细胞产生影响。胶原蛋白家族成员在蛋白酶切割后会暴露出RGD序列，如ⅩⅧ型胶原切割片段内皮抑制素是迄今为止已知最强的血管新生抑制因子。表5-2总结了已知基质蛋白及衍生物和对细胞功能的影响。

基质蛋白合成与降解的动态变化过程称之为细胞外基质重构（extracellular matrix remodeling），其中基质蛋白的合成分泌主要由其邻近细胞完成，而细胞外基质蛋白的降解则依赖于多种细胞外蛋白酶（extracellular proteinases）的切割。细胞外基质重构是与多种疾病发生发展密切相关的病理现象，而细胞外蛋白酶在其中起了举足轻重的作用。目前已知能切割降解基质蛋白的细胞外蛋白酶主要分为金属蛋白酶（metalloproteinase）、胞外丝氨酸蛋白酶等。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）是一类含有锌原子的，活性依赖于 Zn ²⁺和Cu ²⁺的蛋白酶。迄今已发现的MMP有20余种。分为胶原酶（MMP-1，MMP-8，MMP-13，MMP-18）、基质溶解素（MMP-3，MMP-10，MMP-11）、明胶酶（MMP-2，MMP-9）、膜型金属蛋白酶 （MMP-14，MMP-15，MMP-16，MMP-17，MMP-24）及其他型（MMP-7，MMP-12，MMP-19，MMP-20，MMP-26）。每一种成员都可降解多种基质蛋白，如MMP-2可降解Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ型胶原，弹力蛋白，纤维连接蛋白等。

除 MMPs以外，金属肽酶（A disintegrin-like and metalloproteinases，ADAMs）是参与降解细胞外基质的一类重要膜型蛋白酶。在不同物种中已有38种ADAM家族成员被克隆出来，在人类基因组中含有25种ADAM基因（包含 4种假基因），其中只有 13 种 ADAM（ADAM-8、9、10、12、15、17、19、20、21、28、30、33 和 ADAMDEC1）有蛋白水解酶活性，其余 8 种为非蛋白水解酶（ADAM-2、7、11、18、22、23、29、32）。在结构方面，ADAM 的氨基端与MMP的氨基端非常相似。

含Ⅰ型血小板反应蛋白基序的解聚蛋白和金属蛋白酶（A disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type Ⅰ motifs，ADAMTS）是一类继MMP之后新发现的Zn ²⁺依赖的分泌型金属蛋白酶，它区别于其他金属蛋白酶的主要结构特点是羧基端含有至少一个TSP基序，决定了其与底物结合的特异性，底物谱相对较窄。目前在人类体内找到19个成员。ADAMTS家族成员与人类疾病有着密切关系，因为其家族底物谱的特异性，现正成为药物研究的热点靶标，如 ADAMTS-2突变可导致EDS综合征，ADAMTS13突变使其不能正常切割vWF导致血栓性血小板减少性紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP），ADAMTS-7 最近被全基因组关联分析和动物模型证实是动脉粥样硬化重要的致病基因。

胞外丝氨酸蛋白酶（extracellular serine proteinase）的活性依赖于酶分子中的丝氨酸。其中最重要的是具有广泛底物特异性的纤溶酶，该酶不仅能分解纤维蛋白，还能分解纤维连接蛋白、层粘连蛋白和胶原片段。纤溶酶原激活物（plasminogen activator，PA）分为尿激酶型（uPA）和组织型（tPA），它们能将纤溶酶原转为活性的纤溶酶。tPA主要介导血凝块的溶解，uPA则在组织重建中起作用，并与肿瘤转移有关。此外，免疫细胞在活化过程中会释放多种丝氨酸蛋白酶，降解炎症局部细胞外基质，与炎症进展密切相关，如中性粒细胞产生的弹力酶、组织蛋白酶 G（cathepsin G）及蛋白酶 3（protease 3）。