细胞自噬是一类依赖于溶酶体的蛋白质降解途径，在真核生物中非常保守。自噬能够感受细胞所处环境的各种信号，如氨基酸、糖等营养物质的缺乏、pH或渗透压的改变等，使细胞做出应激反应，在恶劣环境下存活。同时，自噬过程会清除细胞内错误折叠或聚集的蛋白质、受损或老化细胞器以维持细胞内部稳态。细胞自噬是继细胞凋亡后，生命科学领域的又一热门研究方向。

自噬又称为Ⅱ型程序性细胞死亡（typeⅡ programmed cell death），是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”的一系列生化过程。正常细胞内的物质主要有两种降解途径，一种通过蛋白酶体被降解，另一种是通过自噬作用。自噬主要降解细胞质的长寿命蛋白和一些细胞器的降解，这种降解有助于细胞内组分和细胞器的正常更新，而蛋白酶体主要降解胞内的短寿命蛋白。根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞可分为3种主要方式：大自噬（macroautophagy）、小自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）。无论大自噬还是小自噬都可以选择性和非选择性吞噬大的物质，CMA为胞质内蛋白结合到分子伴侣后转运到酶体腔中，被溶体酶消化。通常所说的自噬即指大自噬，也是目前研究最多的。

自噬包括生理条件的基础型自噬和应激条件下的诱导型自噬。细胞自噬主要包括以下过程：

（1）自噬诱导，诸如辐射、饥饿、缺氧、细菌入侵、生长因子匮乏等多种因素均可诱导自噬发生。

（2）囊泡（吞噬泡）成核，细胞内质网膜、线粒体外膜、高尔基复合体膜或质膜等构成囊泡的双层或多层膜结构，30多种自噬相关基因（autophagyrelated gene，ATG）蛋白在囊泡膜上顺序耦联组装成前自噬体结构（pre-autophagosomal structures，PAS）。其中，Beclin1/BECN1（Atg6）作为构成Ⅲ类PI3K复合体的支架蛋白，通过Vps34-p150复合体与 Atg9、Atg14L 和 UVRAG （ultraviolet radiation resistance-associated gene protein）等蛋白结合，形成PI3K核心复合体启动自噬。

（3）自噬体的成熟，PI3K核心复合体转变成PtdIns（3）P （phosphatidylinositol 3-phosphate），PtdIns（3）P作为 “着陆台”，募集自噬蛋白进入到吞噬泡（phagophore）成核中心，在泛素化耦联系统的辅助 下，Atg10、Atg7、Atg3、Atg8/LC3、Atg4 和Atg12-Atg5-Atg16L1等最终被募集到 PAS，参与囊泡膜延伸和自噬体（autophagosome）的成熟。

（4）自噬溶酶体的融合，自噬体通过酸化与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autophagolysosome）。自噬体膜的受体蛋白SQSTM1/p62接受酶作用的底物（错误折叠蛋白或蛋白聚合体），降解p62及其靶蛋白，清除线粒体、内质网等受损细胞器，释放出营养物质和ATP供细胞再利用。此外，p62还与自噬活性呈负相关性，反映自噬溶酶体溶解酶活性和自噬潮（autophagic flux）的强弱，因此可作为自噬的分子标记。

自噬通常分为3种：大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬。

大自噬的特征是有独特的双层膜结构-自噬体形成，自噬体包被胞质成分，如蛋白质聚集体，损伤或者衰老的线粒体、过氧化物酶体等，最终与溶酶体融合。小自噬则是溶酶体内陷，包裹部分胞质进入溶酶体，没有独立的双层膜自噬体形成。而分子伴侣介导的自噬则是由特定蛋白 Hsc70等介导，具有选择性。此外，大自噬和小自噬针对包含的内容物种类又都有选择性和非选择性。相对于我们常提到的非选择性自噬，选择性自噬常见有细胞质-囊泡靶向通路（cytoplasm-to-vacuole targeting pathway，Cvt pathway）、过氧化物酶体自噬和线粒体自噬、内质网自噬等。这些选择性自噬的主要过程与非选择性的自噬有一定的相似性。但是，选择性自噬的特征是有自己特异的受体蛋白介导特定的包含物配体，即有识别底物的过程。受体蛋白会与待降解的配体结合并形成聚集体，然后在受体蛋白或者其支架蛋白附近会有囊泡和双层膜形成特异性的自噬体。例如，在酵母中，线粒体自噬的受体是其外膜蛋白Atg32，能够和其他 Atg核心蛋白结合，使受损老化的线粒体进入自噬体。而与线粒体自噬非常类似的是过氧化物酶体自噬。酵母从含甲醇或者油酸的培养基中转换到含糖或氨基酸的正常培养基中会发生过氧化物酶体自噬，Atg36和Pp Atg30是该自噬的特异性受体，Pex3和Pex14则是特异的配体。

出于维持细胞内环境稳定的目的，正常情况下细胞自噬的基础水平保持在一个较低的状态，在某些“危机”状况下可以快速上调，如：生长激素缺乏、饥饿、细胞重建、细胞内出现过多的受损细胞器或代谢废物等。而自噬的消长受多种因素影响，营养缺乏、胰高血糖素可以诱导自噬；胰岛素抑制自噬。还有研究发现亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸是细胞内自噬性蛋白降解的重要调节因子。细胞肿胀也有同胰岛素一样的抑制自噬作用，在肝组织细胞容积的增大促进糖原、脂肪、蛋白质的合成；抑制自噬性蛋白降解。（图17-2）

由于酵母是较简单的真核细胞，易于进行基因操作，被作为理想的研究模式。目前至少已经鉴定出27种参与酵母自噬的特异性基因，另外还有 50多种相关基因。其命名从最初称为APG、AUT和CVT，现已被统一命名为酵母自噬相关基因（autophagy-related gene，ATG）。哺乳动物自噬基因的命名与酵母相似，但也有个别差异，如酵母的Agts在哺乳动物称为CL3，酵母的iAg6在哺乳动物则称为Bcehnl。随着研究的深入，许多酵母中自噬相关基因的同源物均已在哺乳动物中找到，并分离鉴定成功，这说明自噬是一个进化保守的过程，其分子机制从酵母到哺乳动物十分相似。这一方面揭示了自噬与凋亡之间可能存在的内在联系；另一方面证明了自噬基因在进化上具有高度的保守性。

Atg1/ULK1的激酶复合体在酵母和高等哺乳动物细胞都有类似的作用。Atg1蛋白复合体的核心组成是 Atg1和Atg13，其中Atg13的去磷酸化可以诱导细胞自噬的发生。而很多自噬上游信号的激酶可以调控Atg1复合体的磷酸化，如 Tor（target of rapamycin）激酶复合体、AMPK（AMP-activatedprotein kinase）、PKA（protein kinase A）等激酶都可磷酸化Atg1和Atg13。在营养丰富的环境中，Tor复合体使Atg13处于高度磷酸化状态，在饥饿或者其他的外界压力刺激下，Tor激酶失活，Atg13发生去磷酸化与Atg1发生结合，从而激活 Atg1的激酶活性，使Atg形成二聚体并且发生自身的磷酸化。最近一些新的研究表明，无论Atg13的磷酸化水平如何，Atg13都与Atg1存在一些结合，但是当自噬发生，Atg13的去磷酸化使其与Atg1的结合大大增强，并且与PAS结构的支架Atg17-Atg31-Atg29复合体结合，共同组成PAS，并招募其他Atg蛋白。

Atg1蛋白是自噬过程的核心蛋白中的一个重要的蛋白激酶，但是其底物一直不确定，目前有一系列研究报道了Atg1的不同底物，如Atg1可以磷酸化Atg9，磷酸化的Atg9对于招募Atg8和双层膜的扩展是必需的。

高等哺乳动物细胞中的激酶Atg1的同源蛋白是 ULK1/2。ULK1/2与 ATG13 （与酵母的Atg13同源）、FIP200（与 Atg17同源）和 ATG101（在酵母中无同源物）构成 ULK1/2激酶复合体，与酵母中的该复合体不同的是 ULK1/2、ATG13和FIP200之间是稳定的结合，不受饥饿刺激与否的影响。而且MTORC与ATG13存在结合。值得一提的是，细胞在耐受糖饥饿时，MTORC失活离开ULK1/2-ATG13复合物，而AMPK激酶会被激活，结合并磷酸化ULK1/2，激活的ULK1/2会磷酸化ATG13、AMBRA1以及 Beclin1。ULK1/2的磷酸化对VPS34激酶复合体的组成和活性也有重要影响。

Atg9蛋白在进化中非常保守，是自噬相关蛋白中唯一一个跨膜蛋白，有六个跨膜域。Atg9位于一些细小的单层膜囊泡上，这些囊泡在胞质中定位于特定区域，可看作Atg9位于胞质中的存储库。在哺乳动物细胞中，Atg9也定位在晚期内含泡和反式高尔基（trans-Golgi）膜网中。自噬发生时，Atg9的囊泡会在酵母PAS（或者哺乳动物细胞自噬前体phagophore）同胞质存储库之间来回转运。Atg9囊泡定位在PAS或者自噬前体上需要Atg17、Atg11以及Atg23和Atg27的协助，离开需要 Atg1（ULK1/2）复合体的激活和 Atg2-Atg18（哺乳动物中的WIPI2）复合体。其具体机制有待进一步研究。有观点认为Atg9囊泡为自噬体双层膜的形成提供了起始的膜或蛋白质组分。

复合体Ⅰ的组分包括 Vps15、Atg6（Beclin1）Vps34、Atg14 和 Atg38。该复合体定位在PAS结构或者哺乳动物细胞的自噬前体上，可以结合膜组分，并将脂分子中的磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）转化成 PI3P。PI3P可招募膜结合蛋白Atg18到双层膜上。酵母中蛋白组分中的 Vps15、Atg6（Beclin1）、Vps34 也可同Vps38而不是Atg14结合构成PI3K复合体Ⅱ。其不参与自噬体的形成。哺乳动物细胞中有相似的PI3K复合体Ⅰ，但是其PI3K复合体Ⅱ由UVRAG取代Atg14，参与了内吞作用和自噬。

自噬的分子机制中比较独特的是存在两条类泛素化结合的途径。Atg8和Atg12都是类泛素化的蛋白，Atg8可与脂分子磷脂酰 乙 醇 胺 （phosphatidylethanolamine，PE），Atg12可与Atg5发生共价结合。与泛素化途径中存在的E1-E2-E3激活和连接酶类似，该途径的E1是 Atg7，E2是 Atg3、Atg10。在 Atg8 （LC3A/B/C，GABARAP）类泛素系统内，Atg8蛋白的 C端被蛋白酶 Atg4剪切，末端变为甘氨酸，之后 Atg7（E1）将 Atg8 传递到 Atg3（E2），在 Atg12-Atg5-Atg16的帮助下，Atg8的 C端甘氨酸 COOH与自噬双层膜上的 PE膜组分的氨基发生共价结合，帮助自噬体双层膜的扩展。Atg12被Atg7传递到另一个E2：Atg10，最后C端与 Atg5中的赖氨酸侧链结合，并结合 Atg16，而 Atg16可与自身结合，形成二聚体，最终 Atg5-Atg12、Atg16构成 2∶2∶2的复合体，该复合体进一步与自噬体的双层膜结合，帮助Atg8定位在双层膜上并控制双层膜的大小和曲度。目前，相继报道了 Atg7、Atg3、Atg10、Atg8 和Atg12-Atg5的蛋白结构，为该途径提供了分子结构上的解释。

自噬蛋白有很多翻译后修饰，如 Atg13、Atg1和 Atg3等会发生磷酸化、乙酰化等多种修饰。乙酰化修饰在自噬的发生中起重要作用。酵母细胞的乙酰化酶 ESA1失活，自噬不能正常发生，通过研究蛋白质的相互作用和质谱分析鉴定，发现ESA1可以乙酰化Atg3蛋白的多个赖氨酸位点，在自噬体形成中促Atg8与 PE的共价结合反应。这一乙酰化修饰对自噬体的正常形成是必需的。泛素化修饰对自噬的影响也有报道。在哺乳动物细胞中，ULK1可发生K63位的多泛素链修饰，这对自噬的发生也是必需的。此外，在自噬中研究最多的是关键的Atg蛋白上的多种磷酸化修饰变化。Atg13被TOR激酶磷酸化，在TOR失活后，Atg13发生去磷酸化才会诱导自噬的发生。去磷酸化的Atg13会与自噬中唯一的激酶 Atg1结合，使得Atg1激酶活性升高，发生自身磷酸化并招募其他 Atg蛋白，如 Atg8、Atg9囊泡等，起始自噬体双层膜的装配。此外，Beclin1可被 ULK1和AMPK磷酸化，激活VPS34复合体，而Atg14可被TOR磷酸化，抑制 VPS34的激酶活性。ULK1还可以磷酸化AMBRA1，使VPS34从细胞骨架上脱离，定位在自噬体起始位置。

Atg蛋白的发现和功能研究阐明了自噬体形成的分子调控机制，但是自噬体形成过程中有一些关键问题依旧有待解答，如自噬体双层膜的来源一直没有确定的结论，目前在哺乳动物细胞中的研究中出现了多种膜来源的模型。自噬体膜的来源有内质网、线粒体膜、内质网和高尔基体的连接组分、高尔基膜、内吞体以及细胞质膜等。

长期以来，在哺乳动物细胞自噬的相关研究中，自噬体形成位置一直是在内质网的膜上或者附近。研究发现蛋白DFCP1（double FYVE-containing protein 1）定位在内质网和高尔基体上，蛋白结构中有两个FYVE结构域可结合PI3P，而在饥饿条件下，DFCP1被诱导在内质网上形成点。LC3的点则出现在DFCP1形成的1μm直径的环状结构的中心。DFCP1的环类似于Ω，该结构被称为欧米伽体（omegasome）。运用3D断层扫描显微成像技术展示出细胞内该结构实际上是三明治式的夹层，形成欧米伽体的分离膜组分被两层内质网夹在中间，分离膜组分有一细小管与内质网膜相连，进一步证实了欧米伽体的结构存在。在分离的膜组分扩大延伸的过程中，内质网可能持续提供膜。而且70%的自噬体中含内质网成分，表明欧米伽体形成自噬体是基于内质网膜。

小分子化合物3-甲基腺嘌呤（3-MA）是复合体PI3K激酶的抑制剂，阻止PI3P的产生，会抑制欧米伽体的形成，表明欧米伽体定位在内质网上脂分子PI3P高含量的位点。而PI3K复合体Ⅰ的组分，Atg14在内质网上定位，对自噬体的形成非常重要。饥饿时，Atg14由均匀分布变为内质网上的斑点。Atg14蛋白的N端有保守性很高的半胱氨酸重复序列，这对其定位是必需的。突变该位点也阻止了自噬的发生，进一步说明内质网在自噬体的形成中发挥重要作用，提供了形成位点和膜组分。

研究人员早已发现线粒体膜与自噬体双层膜的关系密切。有研究表明，饥饿时蛋白YFP-Mito TM线粒体外膜的标记物，与LC3标记的膜有共定位，但是线粒体的内膜和内部基质蛋白却与LC3没有共定位。值得一提的是，只有外膜的外层脂分子锚定的蛋白才与LC3有定位，而如果是跨过外膜脂双分子层的蛋白，则不会与LC3有共定位。研究者认为这种情况是因为欧米伽体分离出的膜与线粒体外膜相连，但是连接处的高曲度阻止了跨脂双分子层的膜蛋白进入。该研究表明，细胞饥饿时线粒体的外膜贡献了自噬体的双层膜。

对于自噬体双层膜来源于内质网和线粒体外膜两种学说，最近有研究提出，将两者整合在一起。他们发现自噬体实际上起始于内质网和线粒体的交接处，而 YFP-Mito ^cb5TM很有可能是通过该连接处到了欧米伽体的分离膜。已知该位点存在，并且在线粒体的分裂、钙信号的传导、脂分子的转运中有重要作用。内质网和线粒体外膜交界处的膜结构称为MAM（mitochondria associated membrane），细胞饥饿后，在密度梯度离心分离出的MAM中有PI3K复合体。而Atg5在饥饿条件下在内质网上形成点，同时也与线粒体存在动态的结合。破坏该交接点后，抑制了Atg14和LC3点的形成，自噬体也不能正常形成。

内质网的COPII小泡参与了内质网到高尔基的蛋白质转运过程。很早就有COPII小泡形成与自噬关系密切的报道。在酵母的COPII形成缺陷的突变体中，自噬体形成受阻，但是这些实验并不能证明自噬体形成与COPII形成的直接关系。最近研究表明，内质网到高尔基体的COPII形成的抑制剂会减少Atg14和Atg16L点的形成，抑制自噬体的发生，说明COPII小泡出芽在自噬体形成早期起重要作用。在酵母中的研究表明，PAS定位靠近液泡和内质网膜，而形成中的自噬前体与COPII小泡的出芽位置ERES靠近。在自噬体形成中该位置也有Atg9囊泡和Atg2-Atg18复合体定位。通过蛋白质组学发现，COPII转运小泡的组分Sec23与多个Atg蛋白有相互作用，既定位在自噬体膜上，又定位在自噬体与内质网的相接部分ERES上。目前，自噬体的形成与内质网的出泡点的关系尚不清楚。但与此一致的是，内质网到高尔基体的膜转运在自噬中发挥重要作用。

内质网-高尔基体中间体（endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment，ERGIC）可能为自噬体双层膜提供膜组分。Atg5敲除的MEF细胞中的膜成分，本不能与LC3结合，却能在正常细胞的胞质裂解液中结合LC3。这些膜成分的密度梯度离心显示，LC3的定位与ERGIC膜蛋白的位置一致。通过抑制剂破坏掉ERGIC，减少了LC3与PE的共价结合和点的形成，也减弱Atg14L在内质网膜的定位。

Atg16与质膜的网格蛋白（clathrin）有结合，定位在网格蛋白包被的囊泡上。抑制网格蛋白介导的内吞也减少了Atg16的点和自噬体的数量。SNARE蛋白也定位在含有Atg16的囊泡上，介导囊泡的融合。敲低这些SNARE蛋白会抑制自噬体的形成，可能是Atg16的囊泡融合到了分离的膜组分中。Atg9囊泡可通过网格蛋白网格蛋白和 AP2运到质膜上，与 Atg16不同的是Atg9只定位在有 EEA1的初级内吞泡上，但是Atg9和Atg16最终都会定位在有Rab11的次级内吞泡上。因此，基于Atg9和Atg16在质膜和次级内吞泡的定位，该膜结构很可能为自噬体的形成提供膜或蛋白质成分。循环的内吞泡在自噬体的形成中有重要作用。

Atg9有部分定位在内吞泡。SNX18蛋白也可调控细胞自噬。SNX18含有BAR结构域，能感受膜的曲度。SNX18可通C端的PX-BAR结构域与Atg16L结合，通过N端的LIR序列LC3结合。而且SNX18和Atg16L都定位在内吞泡上，可能为自噬体提供脂的来源。

哺乳动物细胞的Atg9囊泡与LC3定位，参与自噬体双层膜的形成是被人熟知的。但是，利用免疫电镜成像一直观察不到自噬体上的Atg9蛋白。Atg9的囊泡可能只是瞬时同分离膜或者自噬体结合。一系列研究表明，Atg9囊泡可以聚集而且融合，这可以是分离的膜组分的起始膜来源。值得注意的是，酵母中的研究表明，在一个自噬体形成中只需要少数几个Atg9囊泡即可完成。高分辨率显微镜观察到大概3个囊泡会定位在PAS上，帮助双层膜的起始，最终囊泡上的 Atg9定位在外膜上，在自噬体形成后离开，该过程没有更多的Atg9囊泡参与。然而，这几个Atg9的囊泡不足以完全提供自噬体的双层膜，因此，自噬体双层膜扩展过程中存在其他的膜来源。而Atg9的囊泡对自噬体双层膜的起始过程是必需的。

生理性自噬是细胞的自我保护机制，有益于细胞的生长发育，保护细胞防止代谢应激和氧化损伤，对维持细胞内稳态以及细胞产物的合成、降解和循环再利用具有重要作用。但自噬过度可能导致代谢应激、降解细胞成分、细胞死亡等，打破细胞生长和死亡间的平衡。下面列举几个与自噬作用有关的疾病：

溶酶体蛋白LAMP-2的缺失是导致Danon疾病的主要原因，这是一种X连锁的空泡化心肌病和肌病。灭活大鼠溶酶体蛋白LAMP-2可以导致自噬小体在细胞内聚集并产生Danon疾病的动物模型。自噬小体的聚集与mannose 6-phosphate receptors recycling to the trans-Golgi network的缺乏有关。这些结果提示LAMP-2可能与mannose 6-磷酸化受体循环有关。还有一些肌病也以自噬小体的聚集为特征，尚有待于进一步区别是由于溶酶体/自噬作用基因的改变引起的病变还是自噬作用只是作为病变的一种结果。

虽然自噬作用可以清除在内质网内外堆积的错误折叠蛋白质，但是过量的自噬作用可以导致一些神经变性疾病的病理变化，如通过改变huntingtin蛋白的变异体，可以导致Huntington病，改变amyloid前体蛋白可以导致Alzheimer病。揭示由错误折叠蛋白质引发的自噬作用的机制可能成为治疗的潜在靶点。

自噬作用在肿瘤的进展中也起到很重要的作用。Beclin1的高表达可以诱导培养的乳腺癌细胞发生自噬作用并抑制其成瘤作用。事实上，beclin1在40%～70%人乳腺癌和卵巢癌中出现单位点缺失。有报道认为beclin1是一个haploinsufficient肿瘤抑制基因。Beclin1蛋白质能够在核和胞质中穿梭，虽然并不知道该蛋白在核内的功能，但是核内的Beclin1蛋白并不能够控制乳腺癌细胞的自噬作用也不能抑制肿瘤的形成。因为自噬作用是在一些肿瘤抑制蛋白的调控下进行的，如Beclin1、10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome ten，PTEN），所以自噬作用的下降与肿瘤进程相关。尽管与正常细胞相比，肿瘤细胞的自噬作用下降了，但是抗癌药物可以诱导肿瘤细胞的自噬作用。现在还不知道自噬作用是一种保护性的机制还是替代凋亡的一种死亡机制，并不能排除有限的自噬作用是一种适应性的机制，以此来帮助肿瘤细胞克服营养供应的匮乏。