第四节核酸的理化性质_生物化学（第4版）（全国高等学历继续教育“十三五”（临床专升本）规划教材）-QQ阅读男生玄幻网

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第四节　核酸的理化性质

一、核酸的一般性质

核酸是两性电解质，含有酸性的磷酸基和碱性的碱基。磷酸基的酸性较强，核酸分子通常表现为较强的酸性。在一定pH条件下，核酸带有电荷可用电泳或离子交换方法分离。在碱性条件下，RNA不稳定，可在室温下水解，利用这个性质可以测定RNA的碱基组成，也可清除DNA溶液中混杂的RNA。

核酸是线性高分子化合物，在水溶液中表现出极高的黏性。一般情况下，RNA分子远小于DNA，所以黏度要小得多。

核酸多是线性大分子，人的二倍体细胞DNA若展开成一直线，可长达1.7m，分子量为3×1012；大肠埃希菌染色体DNA为闭合环状，总长约1.4mm，分子量为2.7×109。

二、核酸的紫外吸收性质

核酸分子的碱基含有共轭双键，在260nm波长处有最大紫外吸收，可以利用这一特性对核酸进行定量和纯度分析。常以260nm处的吸光度（absorbance，A）进行计算，即A260=1.0时，相当于双链DNA的浓度为50μg/ml；单链 DNA 的浓度为 37μg/ml；RNA 的浓度为 40μg/ml；寡核苷酸的浓度为 20μg/ml。

在生物样品中，对紫外线有吸收作用的分子主要是蛋白质和核酸，蛋白质最大紫外吸收波长是280nm。所以可以测定260nm和280nm波长处溶液的吸光度，用A260/A280比值来判断核酸的纯度，纯DNA的A260/A280大于1.8，纯RNA的A260/A280应达到2.0，若有蛋白质的污染，此比值会下降。

三、核酸的变性、复性与分子杂交

（一）DNA变性

DNA变性是指在某些理化因素的作用下，DNA双链互补碱基之间的氢键发生断裂，变成单链的现象。DNA变性的本质是互补碱基之间的氢键断裂而破坏DNA的高级结构，但不影响其一级结构即核苷酸的排列顺序。引起DNA变性的理化因素有加热、酸、碱、尿素和酰胺等。DNA变性后其理化性质发生一系列改变，如黏滞度下降、紫外吸收值增高、酸碱滴定曲线改变等，同时失去生物学活性。

实验室最常用的DNA变性方法是加热。DNA变性使原来位于双螺旋内部的碱基暴露，造成260nm处的紫外吸收值增高，这种现象称为增色效应（hyperchromic effect）。在DNA热变性过程中，以温度相对于A260作图，得到的曲线称为解链曲线或融解曲线（图3-14），从曲线可以判断温度对变性的影响，DNA的热变性是爆发性的，解链是在很小的温度范围内，在这一范围内，A260达到最大值一半时的温度称为DNA的解链温度（melting temperature，Tm），Tm是DNA双链解开50%时的环境温度。Tm值与DNA分子中碱基组成有关，G+C含量越高，Tm值越大；A+T含量越高，Tm值越小。Tm值可以根据DNA分子大小及其GC含量计算，计算公式为：Tm=69.3+0.41（%G+C），小于 20bp 的寡核苷酸片段的Tm值可用公式Tm=4（G+C）+2（A+T）这是因为G与C之间有3个氢键，比A与T之间多1个氢键，所以，解开G与C之间的氢键要消耗更多的能量。

图3-14　DNA解链曲线

（二）复性

DNA的变性是可逆的，解开的两条链可重新缔合形成双螺旋，这一过程称为DNA的复性（renaturation）。热变性后温度缓慢下降时，DNA的复性又称为退火（annealing）。复性的最佳温度一般比Tm低25℃，这个温度称为退火温度（annealing temperature）。若复性的温度缓慢下降，可以使DNA复性至天然状态，若在DNA变性后，温度突然急剧下降到4℃以下，复性则不能进行，这是保存DNA变性状态的良好办法。复性使得变性DNA恢复其天然构象，DNA的A260随复性过程逐渐降低，此现象称为减色效应（hypochromic effect）。

在复性过程中，只要核苷酸序列含有碱基互补片段，不同来源的核苷酸单链之间可形成杂化双链（heteroduplex），这一过程称为核酸分子杂交（hybridization）。杂交可以形成DNA-DNA杂交双链，也可以形成DNA-RNA杂交双链，以及RNA-RNA杂化双链（图3-15）。

分子杂交在分子生物学和分子遗传学研究中应用十分广泛，已成为生命科学研究不可缺少的技术之一，也是基因诊断最常用的基本技术。

理论与实践

分子杂交与临床诊断

分子杂交是利用核酸分子的碱基互补原则，使单链DNA或RNA分子与具有互补碱基的另一DNA或RNA片断结合成双链。该技术可用于鉴定基因的特异性，即将具有已知序列的DNA片段，用放射性核素、化学荧光物或生物素等标记构成核酸探针，通过分子杂交与缺陷的基因结合，产生杂交信号，从而把缺陷的基因显示出来。这对临床诊断具有重要意义，可对许多遗传性疾病、细菌或病毒等感染性疾病、肿瘤等做出准确诊断。

图3-15　核酸分子的变性、复性和杂交

四、核酸的催化性质

核酶（ribozyme）是具有催化活性的RNA片段，1982年首先发现四膜虫rRNA前体具有自我催化作用，并提出了核酶的概念。现已发现多种核酶，其中最简单核酶的二级结构呈锤头状，称为锤头核酶（hammerhead ribozyme）。锤头核酶大小约60个核苷酸，有13个保守核苷酸序列；3个茎和1～3个环组成酶的催化核心和底物剪切位点（图3-16a）。锤头核酶结构特点的发现，使人们能够设计出用于剪切靶mRNA或其前体的核酶（图3-16b），在抗癌和抗病毒方面发挥作用。

图3-16　锤头核酶的结构

a：锤头核酶的结构；b：锤头核酶的作用示意图

可以水解核酸的酶称为核酸酶（nuclease）。若按底物专一性分类，作用于DNA的核酸酶称为脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase），作用于 RNA 的核酸酶称为核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）。有些核酸酶专一性较低，既能作用于DNA也能作用于RNA，因此统称为核酸酶。

根据核酸酶对底物作用的方式不同，可将核酸酶分为核酸外切酶（exonuclease）和核酸内切酶（endonuclease）。核酸外切酶仅能水解位于核酸分子链末端的磷酸二酯键，若从3′端开始逐个水解核苷酸，称为3′→5′核酸外切酶，若从5′端开始逐个水解核苷酸，称为5′→3′核酸外切酶。而核酸内切酶只催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。20世纪70年代，在细菌中陆续发现了一类核酸内切酶，它们对酶切位点具有核酸序列特异性，称为限制性核酸内切酶（restriction endonuclease），简称限制酶。限制性核酸内切酶的研究和应用发展很快，许多已成为基因工程研究中必不可少的工具酶。