第一节　药敏测定

进行细菌体外药物敏感性测定的主要目的：①预测药物体内抗菌活性，指导临床抗菌药物的选择；②筛选获得性耐药细菌，避免产生或加重细菌的耐药性；③评估药物对某种病原菌的体外抗菌活性或预测新型抗菌药物的临床治疗潜能以及抗菌谱；④监测细菌耐药性的变迁，掌握耐药细菌感染的流行病学，为临床经验性用药提供参考依据。常用药敏方法简述如下：

一、 常用药敏测定方法

在琼脂上接种待测菌后，将含有定量抗菌药物纸片贴在琼脂表面，纸片中的药物在琼脂中扩散；随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数降低，在纸片周围形成浓度梯度。过夜培养后待测菌在纸片周围一定距离开始生长，形成透明抑菌圈。抑菌圈的大小可反映细菌对所测定药物的敏感程度，并与抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即MIC越小，抑菌圈直径越大。

纸片扩散法是最为经典、简便、经济、选药灵活的药敏测定方法，目前在临床微生物实验室应用比较广泛。此方法只适用于大多数快生长的需氧菌。对于某些菌种（如李斯特菌属、厌氧菌等），由于需要特殊的培养基、不同的孵育环境，或者菌株间的生长速率差异较大等原因，尚没有标准的纸片扩散法操作程序及判定折点，因此必须作MIC测定。

①在操作过程中，应尽量挑取单一菌落，防止不同菌种间的污染；②配制菌悬液浓度应适当，一般要求0.5麦氏浊度；③不同菌种、不同药物的孵育时间、孵育温度和CO₂环境的需求略有不同，应严格按照CLSI推荐条件进行；④所用纸片均为缩写，应避免药物间的混淆；⑤不同标本来源，所选取的抗菌药物组合会略有不同，如尿液、脑脊液等；⑥该方法得到的是抑菌圈直径，不是MIC值，故对临床治疗的指导作用不如MIC值更加直观可靠。

琼脂稀释法是将含不同浓度的药物混匀于琼脂平板培养基中，采用多点定量接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，MIC值为抑制细菌生长的琼脂平板所含的最低药物浓度。

琼脂稀释法可得到定量的MIC值，可用于没有纸片扩散法折点的菌种和药物，新抗菌药的体外抗菌活性测定，以及有关耐药性与耐药机制的科研。

新制备的M-H琼脂平板可当天使用或密封于塑料袋中4～8℃保存，对一些不稳定的抗菌药物，如亚胺培南、头孢克洛、克拉维酸复合制剂、氨苄西林、甲氧西林等应尽可能使用新鲜平皿。接种菌量对药敏结果MIC值可以产生明显影响，对琼脂稀释法来说最终的接种量为每点10⁵CFU。另外，该方法工作量较大，费时费力。该方法不适用于达托霉素的药敏测定。

基于肉汤稀释法，实现微生物孵育与检测的一体化。采用比浊法检测液体培养基中细菌的生长状况或者检测特殊培养基中荧光基质的水解作用。若细菌生长受抗菌药物抑制，则相应孔位浊度降低；不受抑制则孔位浊度增加。

自动化药敏检测系统被用于临床微生物室常规检测，近年来应用有增多趋势，相对于纸片扩散法药敏测定，节省劳动力。系统携带的药敏专家系统具有自动化、智能化、标准化等优势，并与实验室信息系统连接。专家系统可以对所得药敏结果进行自动验证，识别异常表型，提示试验中可能出现的技术错误，以便实验室工作人员进行确认。专家系统还能通过微生物药敏谱预测被检测细菌可能的耐药机制，方便实验室修正药敏报告，正确指导临床治疗。目前，国内常用的药敏检测系统有Vitek 2 compact、Phoenix 100等。

浊度技术出现云雾状浊度或片状沉淀物时，可被自动化阅读仪遗漏，导致结果错误。荧光法比浊度法更为灵敏，但由于荧光检测技术是间接的，检测结果可能受细菌对荧光底物的代谢能力等因素的影响。为更快地得到药物敏感性试验结果，对标准药物敏感试验方法进行改良，如提高接种细菌的浓度，使用特殊生长培养基，以加快细菌生长或利于细菌耐药检测。另外，自动化药敏检测系统存在抗菌药物种类及数量局限，某些药物折点改变不能及时更新，药敏专家系统升级延迟等缺陷。

浓度梯度法是一种结合稀释法和扩散法原理对抗微生物药物直接定量的药敏试验技术。常用的浓度梯度法所用试条是一条5mm×50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的、浓度呈连续指数增长的抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC稀释浓度的范围，其斜率和浓度范围对判别有临床意义的MIC范围和折点具有较好的关联。

浓度梯度法适用范围广泛，并且操作简便，可直接获得菌株的MIC结果。但价格较高，临床实验室主要作为其他药敏检测方法的补充，例如，仅有MIC折点而无纸片扩散法折点，纸片扩散法不适用仅能进行MIC测定或根据临床需要在全自动药敏检测结果的基础上单独增加某种药物的药敏试验。此方法也用于科研工作。

药敏结果的正确读取是浓度梯度法准确可靠的前提，因此需要严格根据说明书对特殊菌属（如变形杆菌属）、药物（替加环素等）的结果进行正确判读。浓度梯度法与CLSI的稀释法获得的MIC结果呈高度相关性，CLSI MIC折点适用于浓度梯度法。

二、 药敏测定的临床意义

根据抑菌圈的大小或MIC值，参照药敏折点标准“敏感（S）”、“中介（I）”、“耐药（R）”判定结果。

1. S表示通常情况下，使用推荐剂量的该药物时，感染部位所能达到的药物浓度能够抑制该菌株的生长。

2. R表示常规剂量的药物在感染部位通常达到的药物浓度，不能抑制菌株的生长或者证实菌株存在某些特定的耐药机制（如产生β-内酰胺酶等）或者治疗显示药物对该菌的临床疗效不可靠。

3. I表示血液和组织中通常可达到的药物水平接近菌株的MIC，药物治疗的反应率可能低于敏感株。I还意味着药物在生理浓集的部位具有临床疗效（如尿液中的喹诺酮类和β-内酰胺类浓度较高）或者可以使用高于正常剂量的药物进行治疗（如β-内酰胺类）。同时，I还代表缓冲区，防止微小的、未能控制的技术因素造成重大的结果解释错误，特别是对那些安全范围窄的药物。

4. CLSI M100-S24（2014年）新引入肠杆菌科药敏试验的“剂量依赖性敏感（SDD）”的概念，CLSI建议报告肠杆菌科细菌头孢吡肟药敏试验时，用“SDD”替代“中介”。当菌株的头孢吡肟MIC为4或8mg/L（或抑菌圈直径19～24mm）时，报告为SDD，提示使用高剂量方案治疗感染。

体外药物敏感性测定能够预测药物体内活性，但是药物在体内的作用受到多方面因素的影响，例如宿主对药物的反应性、基础疾病、感染部位、药物代谢动力学等，导致体外药敏与体内活性不一致的现象。

三、 不同菌种药敏测定的抗菌药物选择

对于分离的可疑病原菌，若不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。以下情况不必进行药敏试验：正常菌群与感染的关系不明确时；污染菌；已知细菌对某种抗生素天然耐药或全部敏感。不同菌种进行药敏测定时应考虑抗菌药物的抗菌谱、细菌的耐药机制、抗菌药物的药代动力学特点、流行病学资料、菌株的分离部位和天然耐药等因素。

药物的选择主要分为A、B、C、U四个组：①A组药物用于常规和首选试验，其结果也应常规报告。②B组包含一些临床上重要、特别针对医院感染的抗菌药物，可用于首选试验，但只是选择性地报告临床。例如当细菌对A组同类药物耐药时，可选择性报告B组中的一些结果。B组其他报告指征包括以下几点：特定的标本来源（如第三代头孢菌素对脑脊液中的肠杆菌科菌，或者磺胺甲唑/甲氧苄啶对泌尿道的分离菌株）；多种细菌感染；多部位感染；对A组药过敏、耐受或无效的病例；以流行病学调查为目的向感染控制部门报告。③C组包括替代性或补充性抗菌药物，可在以下情况进行试验：某些单位潜在有局部或广泛流行的对数种基本药物（特别是同类的，如β-内酰胺类或氨基糖苷类）耐药的菌株；对基本药物过敏的患者；少见菌的感染（如氯霉素对肠道外分离的沙门菌属或耐万古霉素的肠球菌）；以流行病学调查为目的向感染控制部门报告。④U组包含某些仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物（如呋喃妥因和某些喹诺酮类药物），这些药物对除泌尿道以外的感染部位分离的病原菌不应常规报告，主要针对一些特定的泌尿道致病菌。常见耐药革兰阴性菌不同组别的常规测试药物见表2-1。

表2-1　肠杆菌科菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌常规测试的抗菌药物

续表

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注意：表中同一小框内的药物类似，其结果解释和临床疗效都很接近，不必同时测定药敏，例如，对头孢噻肟敏感的肠杆菌科菌株，被认为对头孢曲松也敏感；而“或”字表示一组相关的药物，其抗菌谱和结果解释几乎完全相同，所以通常在每个小框中”或”的药物只选择一种抗菌药物进行试验。当肠杆菌科菌、鲍曼不动杆菌对常规测试的抗菌药物均耐药，应该进行替加环素药敏试验并报告MIC值。

*仅用于MIC试验；纸片扩散法不可靠。

_a四环素敏感的菌株也被认为对多西环素和米诺环素敏感。然而，四环素中介或耐药的某些菌株可以对多西环素或米诺环素或者两者敏感。

^b 分离于泌尿道的菌株不作为常规报告。

^c 当治疗由大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌引起的非复杂性尿路感染时，可用头孢唑林的结果去预测口服药物头孢克洛、头孢地尼、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢呋辛酯、头孢氨苄和拉氧头孢的结果。但头孢泊肟、头孢地尼、头孢呋辛酯可单独测定，因为部分菌株在对头孢唑林耐药时，可以对这3种药物敏感。

^d对于沙门菌属和志贺菌属，第一、二代头孢菌素，头霉素类可能会出现体外敏感，但临床治疗无效的情况，此时这些药物不应该报告敏感。对于粪便标本分离的沙门菌属和志贺菌属，只需要常规报告氨苄西林、一种氟喹诺酮类和甲氧苄啶/磺胺甲 唑。对于从肠道外分离的沙门菌属应该测定并报告一种第三代头孢菌素，同时氯霉素也可根据需要测定并报告。仅对肠道或非肠道来源的伤寒样沙门菌属（伤寒沙门菌和副伤寒沙门菌A～C群）进行体外药敏的测定，其他肠道来源的非伤寒样沙门菌属不需要常规测定其体外药敏。

^e对CSF分离株，头孢噻肟或头孢曲松替代头孢唑林进行测定。

四、 依据耐药表型推测可能的耐药机制

药敏报告是用来指导临床医生选择及调整抗菌药物的主要依据，有利于患者感染性疾病的治疗，正确解读药敏结果就成为抗菌药物正确选择和使用的关键。肠杆菌科菌对常用β-内酰胺类药物耐药表型及可能的耐药机制总结见表2-2，希望能够增强临床医生对体外药敏结果的正确理解。

ESBLs可水解青霉素类、第一代头孢菌素、第二代头孢菌素、大部分第三代头孢菌素、头孢吡肟和氨曲南，不能水解酶抑制剂复合制剂、头霉素类和碳青霉烯类。不作ESBL检测时，肠杆菌科细菌对头孢呋辛、头孢噻肟或头孢曲松耐药，基本上就是产ESBL菌株。不同基因型水解底物谱有差异，不是所有的产ESBL菌株对青霉素类、头孢菌素和氨曲南均耐药。如果在药敏报告中大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌对青霉素类，第一、二代头孢菌素，头孢噻肟，头孢曲松耐药，而对头孢他啶、头孢吡肟或氨曲南中介/剂量依赖敏感或敏感，且ESBLs阳性，提示可能产CTX-M型酶。对于这些菌株引起的感染，采用头孢他啶或头孢吡肟治疗可能有效。但随着ESBLs新基因型的不断出现，其药敏谱型也越来越复杂，所以临床的治疗还应该根据具体的药敏结果来选择用药。

可水解青霉素类、头孢菌素类、头霉素类和单环类，而不能水解碳青霉烯类和第四代头孢菌素。诱导型和结构型AmpC酶主要见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、沙雷菌属、普罗威登菌属及摩根菌属中。质粒型AmpC酶主要见于肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等肠杆菌科细菌。但随着新基因型的出现，以及ESBLs和AmpC酶同时存在情况的出现，有时很难通过药敏谱型去判断其背后的耐药基因型。

表2-2　肠杆菌科菌对常用β-内酰胺类药物耐药表型及可能的耐药机制

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注：R：耐药；I：中介；SDD：剂量依赖敏感；S：敏感。

碳青霉烯酶可水解碳青霉烯类，如美罗培南、亚胺培南、厄他培南等。在体外药敏中，并非所有的碳青霉烯类药物均表现为耐药，这与产酶量的多少，以及存在其他耐药机制等有关。在肠杆菌科细菌中，厄他培南一般要比亚胺培南和美罗培南更易于耐药，在作改良Hodge试验时，可表现为阴性或弱阳性；但变形杆菌属、普罗维登菌属以及摩根摩根菌除外，这些菌株因存在碳青霉烯酶以外机制而表现为对亚胺培南的敏感性降低（中介或耐药）。另外，ESBLs和AmpC酶联合膜孔蛋白缺失也可表现为碳青霉烯类耐药。所以，随着耐药机制研究的不断深入，新耐药机制的产生，会使得其耐药谱型间的差异变小，从耐药表型判断耐药机制也就越复杂。