第三节　创伤感染动物模型的选择与应用

创伤感染动物模型的研究和应用领域非常广泛。无论是病原体病原特征、宿主病理生理改变和免疫反应状态等发病机制研究，还是在治疗方法，新药活性评价等转化医学的研究中，该模型的应用都不可或缺。由于创伤感染的病程非常复杂，涉及感染、凝血、炎症和免疫功能等多方面因素，因此模型动物的制备和应用既应遵循基本原则，也应根据研究实际情况进行具体的选择和应用。

一、创伤感染动物模型的选择原则

创伤感染动物模型的制备，首先要求尽可能模拟临床疾病的实际病程，其次均一性和重复性好。为满足上述要求，应同时考虑病原因素和宿主因素，根据研究侧重点的不同选择特定的致伤方式结合特定的病原体感染种类，在保证操作便捷和稳定性可控的前提下，应尽可能模拟临床患者的病情变化规律。根据上述建模思路，创伤感染动物模型的制备应具体遵循以下原则：

1. 模型动物选择原则

就感染本身而言，其发病受宿主因素的影响较大，如在病毒感染研究中，大多数实验动物感染性不强或不能被感染。因此有关模型动物的选择需综合考虑动物的种类、遗传背景、生物学特征和遗传易感性等方面因素。文献已有报道的创伤感染模型动物包括小鼠、大鼠、兔、犬、羊和猪等。小鼠遗传背景明确，并可对特定的基因表达进行调控操作，同时其个体小，均一性好，且操作简便，因而是目前制作创伤感染模型的首选实验动物。基于上述特征，小鼠创伤感染模型适宜进行生存率指标观察，也可研究某种基因表达水平的高低研究与宿主抗感染免疫反应的相关性及作用机制。虽然小鼠模型具有上述优势，但其个体小，组织和血标本不足以满足复杂检测需求，同时小鼠对病原体的易感性远低于人，且其并发脏器功能障碍和休克的特征也与人类感染存在较大差异。因此在进行感染耐受性以及感染所致血流动力学和脏器功能改变的研究中，兔、犬、羊和猪等大动物也作为模型动物选用。

2. 病原体选择原则

除模型动物的选择外，病原体的种类、活化状态和菌株来源等因素也可直接影响不同创伤部位并发的病原体种类差异较大，因此在人为引入外源性感染因素时，应尽量选用该创伤部位常见的病原体，以充分模拟临床患者的实际病情。如烧、烫伤等表皮创伤合并感染，应尽量选择金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或链球菌等革兰阳性细菌。腹腔创伤合并感染，应选择大肠埃希菌等革兰阴性细菌，而肺部创伤合并感染，可选择铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌或肺炎克雷白菌。另一方面，为控制病原体的活化状态和毒力性质，一般可选用标准菌株进行造模实验，一方面保证动物个体间感染严重程度均一，另一方面也有利于不同实验室之间的相互比较。此外，为研究病原体条件致病和耐药的发生，也可根据实际需求选择特定的病原体类型在创伤合并感染的模型中，常用的病原体类型见下表（表6-2）。

3. 标准化操作原则

除控制动物种类和病原体因素外，建模方法的标准化也同样影响动物模型的稳定性和可重复性。标准化原则主要包含动物标准化和操作标准化两方面。感染是一种变异性极大的疾病，且存在病原体耐受和可诱导等诸多不确定因素。首先应当确定动物的来源、品系、年龄、性别、体重和基础状况。其次应严格控制实验时间以及实验者操作技术熟练程度（包括建模和给药等步骤）等因素。最后在饲喂观察、实验环境控制、消毒、标本处理、数据采集和检测指标等方面也应做到统一和规范。确保模型的稳定重现和实验结果的可靠性。

标准化操作也是保证均一性的前提。在创伤脓毒症的研究中，尽管CLP模型最为接近临床，也被广大国内外研究人员所广泛认同和采用，但迄今为止还没有一套完整可行的标准操作规范，以满足模型稳定性的需求。依照相关文献报道的方法和我们对该模型长期的研究，笔者充分考虑了动物来源、饲喂消毒、手术方法、术后处理等各方面因素，建立了一套操作简单、重复性好、死亡率稳定的CLP建模操作规程。特别是对于穿刺方法进行了重新设计和改进，解决了传统穿刺方法无法实施标准化操作的问题，保证了模型动物的均一性。

4. 临床相似性原则

相似性原则也是创伤感染动物制备的重要因素。虽然没有一种动物模型可以完全模拟临床患者创伤感染的病程变化，但在进行研究时，应尽可能选择贴近临床疾病真实情况的建模方法，以避免因模型选择不当而导致对实验结果的解读出现误判。如在创伤感染并发症脓毒症的研究中，虽然注射模型仍然广泛应用于各类研究中，但近来许多研究者已认识到注射模型引入病原体种类单一，且造成病原体大量和快速进入动物体内，与临床患者局部缓慢起病的病程发展差异较大。因此在新药研究中，如果仅选择注射模型进行研究，就难以真实评价药物的疗效，这也可能是大量在临床前研究获得成功的脓毒症治疗药物均未在临床试验中获得阳性结果的原因之一。因此在有关创伤感染的研究中，采用创伤自发感染或者创伤部位注射、涂抹病原体等模型更能真实反映创伤感染的病程，同时对于治疗方法的疗效评价也更为可靠。

二、创伤感染动物模型的研究应用

创伤感染动物模型在创伤感染及并发症研究中的应用广泛，为创伤感染及其并发症早期识别、诊断和干预的进展提供了大量的理论和实验数据支持。根据研究的侧重点不同，创伤感染模型动物可用于疾病发生规律与病理生理机制的研究，也可用于新型防治措施或防治药物的有效性评价。在有关创伤感染发病机制研究中，主要针对发生创伤感染的易感性特点以及炎症和免疫功能的紊乱改变展开研究。

1. 创伤感染的发病机制研究

研究证实，创伤一方面可直接导致机体生理屏障的破坏，使病原体易于定植和侵袭。另一方面，创伤可造成天然免疫细胞吞噬、杀菌等功能缺陷以及T细胞免疫抑制的发生，从而造成继发性感染的出现。由此可见，创伤感染的发生发展即为在创伤所致机体损伤、屏障破坏或免疫功能紊乱的内环境中，病原体与机体相互作用的病理生理过程。因此创伤感染模型在创伤感染发病机制研究中的应用也主要围绕感染的易感性，感染所致炎症反应及免疫功能紊乱等方面进行。

（1） 感染易感性研究：

创伤感染的发生同时与病原体因素和机体自身状态有关。如病原体种类和侵袭性，宿主年龄、营养状态和免疫功能等因素均可影响创伤后感染的发生及其严重程度。在动物模型中，病原体类型和宿主年龄、营养状态等因素均不易得到控制，故大部分有关模型动物感染易感性的研究围绕机体免疫功能进行。创伤所致的机体免疫系统的紊乱，可直接导致感染易感性的增加，造成外源性或内源性病原体的大量增殖和损害，引发机体出现炎症反应失衡、凝血系统亢进，最终导致脏器功能障碍和循环衰竭。在CLP模型中观察到CD8+ T细胞功能的持续性损害，进而对细菌和病毒感染的耐受性下降。又有研究在腹部创伤模型中发现，精氨酸代谢异常可引起T细胞功能障碍，并导致对感染耐受性降低。

（2） 炎症信号通路研究：

创伤与感染因素均可直接或间接造成机体组织细胞损伤。而炎症反应是机体对组织损伤最直接的应答，多种免疫细胞和炎症相关的细胞因子/趋化因子之间相互协同、拮抗或调控，构成复杂的级联网络。机体促炎和抗炎反应的平衡打破后，特别是在创伤后期抗炎反应过度时，就会增加感染易感性。因此有关炎症调控的研究也是创伤感染的核心内容。在创伤感染模型中检测促炎/抗炎介质的水平和炎症所造成的损伤，一方面可以直接评估炎症在创伤所致机体间接损害方面的作用，另一方面也可以通过研究炎症反应的动态变化规律，证实创伤后感染的发生机制。如有研究建立了大鼠多发性骨折合并背部烧伤感染的序贯模型，观察大鼠发生多器官功能障碍综合征后肝组织炎症相关基因的变化情况，发现肝脏差异表达基因涉及促炎因子和抗炎因子两类炎症介质，基因同时存在表达上调和下调，程度存在差异，并且有内源性保护因子表达，说明MODS状态下全身炎症反应综合征和代偿性抗炎反应综合征同时存在，机体处于炎症失衡状态，器官受损同时有修复过程存在。又有研究在烧伤和盲肠结扎穿孔“双重打击”模型中观察到，一旦IL-10和IL-6显著升高，而瘦素以及IP-10的水平明显下降，则提示感染的发生可能性大大升高。

（3） 免疫功能研究：

在创伤感染的基础研究与临床观察显示，严重创伤感染及其并发症（包括脓毒症）的发生发展与机体免疫功能紊乱密切相关。尤其是在患者后期病程中，表现为淋巴细胞大量凋亡，Th2型免疫占主导地位，是机体发生继发或反复感染、导致预后不佳的主要因素。因此免疫紊乱的研究也是创伤感染模型的重要应用。在创伤模型中即可深入探讨免疫紊乱的发生机制，也可对免疫调节药物防治创伤感染及其并发症的药效进行评估。如利用小鼠截肢伤模型，观察白介素2（interleukin2，IL-2）在体内对创伤小鼠细胞免疫功能及感染后死亡率的影响。结果发现了创伤后出现了免疫抑制，同时IL-2表达也受到显著抑制。而体内应用IL-2治疗，可逆转模型小鼠的免疫抑制，提高生存率，提示IL-2可通过促进创伤后细胞免疫功能，提高对感染的抵抗力。

2. 创伤感染防治药物的临床前研究

动物模型除用于机制研究外，在创伤感染及其并发症防治药物的新药临床前研究中也有广泛应用。新药临床前研究包括主要药效学、一般药理学、药代动力学和毒理学等研究内容。一般药理学、药代动力学和毒理学等研究通常采用的是非模型动物（除外PK-PD研究），因此本章节仅针对主要药效学介绍动物模型的研究应用。根据创伤感染的病理生理特点，其防治药物主要分为抗感染药物以及抗脓毒症（创伤感染的主要并发症）药物两大类。以下为动物模型在这两种类型药物研究中的具体应用。

（1） 抗感染新药研究：

对于抗感染药物的研发而言，是否存在创伤因素不具有特异性，因此此类药物的研发模型与其他感染性疾病通用。一般而言，体外实验仅可用于评估药物与病原体之间的相互作用。而感染动物模型中存在代谢和宿主抗感染机制，因而可反映药物的综合作用。根据研究的目的性，动物模型可主要有如下应用：第一，药物抗感染活性筛选，通常观察生存率的改善情况，以评估药物对感染的控制能力。此类研究中通常要求模型具有一次性建模、操作简便、持续时间短以及研究目标简单确切等特点，且应对于所有药物均适用。根据此种要求，静脉和腹腔注射模型等急性严重感染动物模型是最为适用的模型。如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染药物研究中，可以在小鼠中利用尾静脉注射建模，以生存率指标作为药物疗效的筛选依据。第二，在模拟临床的特异性模型（如肺部、泌尿道等局部感染模型）中观察药物对病理生理指标的改善作用，并评价其适用的感染类型。此类模型强调病原体以及感染部位的特异性，以及与临床感染病情的相似性。在此类模型中，选择的指标更为复杂，如脏器细菌计数、脏器功能、机体炎症反应以及免疫功能状态等均可纳入评价体系。同时药物的剂量、给药时间以及与其他药物的联合用药等也可进行相应的研究和评估。同以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染药物研发为例，在此可选择肺部静滴或皮下植入带菌异物模型，观察局部起病状态下，对于局部脏器功能以及全身其他脏器或循环功能的影响。

（2） 抗脓毒症新药研究：

脓毒症是创伤感染最为常见的致命性并发症。尽管抗菌和支持治疗的手段取得了长足进展，但时至今日，对于脓毒症依然没有有效的防治措施。针对脓毒症发生发展各个关键环节设计的防治药物/方法的研究层出不穷，其中各种脓毒症动物模型的应用在它们的非临床药效评价中发挥了重要作用。根据药物靶点设计的差异，可以选择不同的动物模型进行组合研究，一般而言，首先选择一种单因素的模型用于机制研究，在此基础上再选择一种复合因素的模型或者不同种属的模动物型用于药效研究。如TLR4拮抗剂eritoran的临床前研究中，考虑其以TLR4为靶点，因此就分别选用小鼠、大鼠和比格犬的LPS（TLR4天然配体）注射模型进入体内机制研究，还在小鼠静脉和肺部大肠埃希菌注射模型（携带LPS的活体细菌分子）中进行了药理活性的研究。笔者在一种以细菌病原分子LPS和CpG DNA为双靶标的脓毒症防治药物研制中，首先选择了小鼠LPS和CpG DNA静脉注射模型，以验证该药物在模型动物中对两种靶标的体内拮抗作用，之后用小鼠大肠埃希菌静脉注射模型评价该药物对病原分子复合物的体内拮抗作用，最后分别在小鼠、大鼠和比格犬中建立CLP模型，系统评价该药物对与临床最为接近的模型动物中既观察对存活率的影响，同时也采集血液和脏器标本，检测药物对于脏器和系统功能的改善作用。

三、小结

在止血、抗休克等对症治疗方法取得长足进展的今天。创伤感染已成为影响创伤救治的关键难题。创伤感染的病程受到多种因素的调控，许多重要问题仍有待进一步探讨，而目前尚无一种标准的创伤感染模型能够满足研究的所有需求。因此，根据研究需要，合理选择动物模型开展研究，是确切揭示创伤感染发生规律、寻找针对性精确干预措施的必要前提和基础。

（郑江　刘鑫）