第一节　微生物致病的遗传学基础

微生物致病的能力，首先是由微生物的遗传特性决定的，即微生物具有与致病有关的基因。这里将讨论与微生物致病相关的遗传物质如质粒、噬菌体、转位因子和致病岛等与致病性的关系；致病基因与疾病多样性的关系；致病基因的转移和重组与疾病多样性的关系；突变与疾病多样性的关系等重要问题。

一、细菌的基因组结构及致病岛

微生物学的生物学形状，包括致病性，主要是由基因组决定的。基因是DNA链上编码蛋白质或RNA所必需的一段序列，包括编码和非编码序列，它是遗传的基本单位。细菌的基因组（genome）是指存在于细菌细胞内的所有基因。细菌在一般情况下是一套基因，即一条染色体— 单倍体（haploid）。但已经发现嗜盐古细菌Halobacterium NRC-1菌株包括1条染色体及2个“小染色体”（mini-chromosome，分别为10万及20万bp）组成；霍乱弧菌基因组也是两条染色体，大的一条含2 961 146bp，小的一条含1 072 314bp。但多个染色体上的基因安排是不相同的，故仍然是单倍体。通常基因组是指全部一套基因。由于发现许多非编码序列也具有重要功能，因此，目前基因组的含义实际上是指细胞中基因以及非基因的DNA序列组成的总称，包括编码蛋白质的结构基因、rRNA基因、tRNA基因、调控序列以及目前功能尚不清楚的DNA序列。细菌的基因组一般约由数百万碱基对组成。

细菌基因组多为双链环状DNA分子（但已发现Borrelia burgdorferi疏螺旋体的染色体是线状的），在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中。该小体称为拟核（nucleoid），其上结合有类组蛋白和少量RNA分子，使其压缩成一种致密结构（约压缩1000倍左右）。目前，许多细菌的基因组测序定已经完成，大部分医学微生物都已有代表株完成测序或正在被测序之中。基因组测序揭示了细菌基因组结构的一些基本特征：

1. 遗传信息在基因组中排列的连续性

绝大多数细菌中，约90%左右的基因组DNA都用来编码蛋白质、rRNA和tRNA；其他部分作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别和结合的位点等，也就是说，细菌非常经济地使用它们的遗传序列，没有什么“垃圾序列”。除个别细菌（如鼠伤寒沙门菌、犬螺杆菌）和古生菌的rRNA和tRNA中发现有内含子或间插序列外，其他绝大部分原核生物不含内含子，遗传信息是连续的而不是间断的。

2. 功能相关的基因组成操纵子结构

细菌基因组中，有些功能相关基因常组织在同一个操纵子内。如大肠埃希菌构成核糖体的三种RNA基因转录在同一个转录产子中，它们依次是16S rRNA、23S rRNA、5S rRNA。这三种RNA在核糖体中的比例是1∶1 ∶1。倘若它们不在同一个转录产子中，则容易造成这三种RNA比例失调，影响细胞功能。否则，可能需要一个极其复杂、耗费巨大的调节机构来保持这种1∶1∶1的比例。而安排在同一个转录子中，这个问题就非常经济而巧妙地解决了。大肠埃希菌基因组共有2584个操纵子，基因组注释推测出2192个操纵子。其中73%只含一个基因，16.6%含有2个基因，4.6%含有3个基因，6%含有4个或4个以上的基因。细菌有如此众多的操纵子结构，可能与原核生物的基因表达多采用转录调控有关，组成操纵子有其方便的一面。

3. 结构基因单拷贝及rRNA基因的多拷贝

在大多数情况下，细菌结构基因是单拷贝的，但是编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的。大肠埃希菌有7个rRNA操纵子，其排列都与基因组的复制方向有关，即按复制方向表达。7个rrn操纵子中就有6个分布在DNA双向复制起点ori 附近，而不是在复制终点附近。这是因为，在细菌复制周期中，复制起点处的基因的表达量几乎相当于复制终点的同样基因的两倍。rrn多拷贝地安排在ori附近，这有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时，细胞可以在短时间内大量生成核糖体。枯草杆菌的rrn也有10个拷贝。rrn多拷贝及结构基因的单拷贝，也反映了细菌基因组的经济性与高效性。

4. 基因组的重复序列少而短

细菌基因组存在一定数量的重复序列，但比真核生物少得多，而且重复序列比较短，一般为4～40个碱基。重复的程度有的是十多次，有的可达上千次。流感嗜血菌基因组上有1465个“摄取位点”（其序列为5′AAGTGCGGTCA3′）的重复序列。微生物的绝大部分生物学性状是由其染色体编码的。同样，与致病性有关的基因，大部分也是定位于染色体。并且，这些致病相关基因常常以致病岛的形式出现。

致病岛（pathogenicity island）是细菌染色体上编码毒力相关基因的特殊区域，是在细菌学领域对致病性细菌致病机制的研究中出现的一个新概念，是某些致病性细菌在进化过程中适应环境的变化而获得的毒力基因。许多病原性细菌中都存在致病岛，致病岛通常具有以下特点：

（1） 致病岛携带一个或多个毒力基因，致病岛能编码黏附因子、侵袭因子、铁摄取系统、毒素、Ⅲ型和Ⅳ型分泌系统等已知毒力相关因子。随着研究的不断深入，可能还会发现由致病岛编码的另外的毒力因子。

（2） 致病岛存在于病原菌中，在非致病菌或相关菌株中一般不存在。致病岛最初是在染色体中发现的，但是随着对侵袭性质粒的深入研究，发现这些质粒的某些区域也具典型的致病岛特征，为了加以区别，把它们称为致病岛前体。

（3） 大多数的致病岛大小约数万碱基，但有的近200Kb乃至更大。但有的病原菌常含有1～10kb长的编码毒力因子小DNA片段，相对于大的致病岛，被称为致病小岛（islets）。

（4） 致病岛的G+C含量往往不同于宿主DNA，提示毒力岛是通过基因水平转移获得的。

（5） 致病岛形成一个独特的密集遗传单位，两翼通常带有重复序列。这些重复序列可能是致病岛在插入宿主基因组时通过重组产生的。

（6） 致病岛边缘常常与tRNA基因相连。在许多原核生物和某些真核生物中，tRNA基因常作为外源DNA的整合位点，在致病岛的形成过程中也不例外。提示tRNA基因除具有转运氨基酸的作用外，在致病基因的水平转移中也有重要意义。

（7） tRNA基因的3′端序列常与噬菌体的整合位点相一致。致病岛与tRNA基因的相连，而致病岛侧翼tRNA区常有噬菌体整合酶基因的现象，提示着许多致病岛是由噬菌体衍变而来的。

（8） 致病岛常携带“可转移元件”（如IS元件、整合酶、转座酶等）的编码序列。致病岛一般不含均一序列，表现为一些马赛克镶嵌结构，这是由IS介导不同来源的DNA重组的结果。

（9） 在致病岛中存在质粒同源性序列，提示有些致病岛是由质粒衍变而来的。

（10） 致病岛通常具有不稳定性：致病岛既可以获得，也可以丢失，这通常是由侧翼正向重复序列和内部的IS序列介导的。

目前，已在大肠埃希菌J96株中，发现了两个致病岛，命名为致病岛Ⅰ和致病岛Ⅱ，它们和编码溶血素、P菌毛和细胞毒性坏死因子等有关。致病岛Ⅰ和致病岛Ⅱ分别与编码苯丙酰tRNA的基因pheV和pheR交界，而这两个tRNA基因的3′端在大肠埃希菌和沙门菌中常作为一种接合型转座子的插入位点。此外，在大肠埃希菌CFT073菌株中，也发现一个58kb的致病岛。两侧有一个9bp的正向重复序。该致病岛除编码α溶血素和P菌毛外，还包含了44个开放阅读框（ORFs），其中有的ORFs与大肠埃希菌K12的铁转运基因同源。大肠埃希菌K1是一类具有荚膜的神经侵袭性病原菌，由于所有其他大肠埃希菌都没有荚膜，因此编码荚膜的基因位于致病岛上的可能性很大。研究发现，大肠埃希菌K1的确有这样一个致病岛，也是整合在tRNA基因pheV的3′端，负责荚膜成分聚唾液酸的合成、运输及表达调控。在肠致病性大肠埃希菌和肠出血性大肠埃希菌中，普遍存在一个致病岛LEE，它携带有A/E（attaching and effacing）以及其他一些毒力相关基因，如esc、 esp、eae、tir等。其中eae基因编码一个94kDa的外膜蛋白即紧密素（intimin），紧密素是细菌黏附分子家族成员，介导细菌与肠上皮细胞的紧密黏附。

最早被研究的两个沙门菌致病岛，即沙门菌致病岛1（SPI 1）和沙门菌致病岛2（SPI2）均编码Ⅲ型分泌系统，但这两个分泌系统结构上相似而功能上截然不同。40kb的SPI1至少由25个基因组成，其中基因inv及spa与细菌侵入上皮细胞有关。inv及spa基因簇无论是在大小、序列还是在基因的组成形式上与志贺菌侵袭性大质粒上的一套基因十分相似。SPI2也是一个约40kb的致病岛，它是沙门菌侵入并能在巨噬细胞中存活的主要遗传基础。该致病岛至少包含17个基因，编码一个二元调节系统和spi/ssa Ⅲ型分泌系统。虽然SPI2的许多基因产物与耶尔森菌的高度相似，但SPI2却只存在于沙门菌内。

金黄色葡萄球菌RN4282和RW3984两个菌株分别存在相类似的致病岛1（SaPI1）和致病岛2 （SaPI2），它们均编码毒性休克综合征毒素TSST1，该毒素也可由葡萄球菌噬菌体编码。SaPI1长为15.2kb，两侧翼携带有17bp的正向重复序列，该致病岛含有一个与整合酶基因和一个超抗原毒素编码基因显著同源的类似基因。

二、质粒与致病性

质粒（plasmid）是染色体外的遗传物质，为闭合环状的双链DNA，存在于细胞质中。它带有遗传信息，控制细菌某些特定的遗传性状；能在细胞质中独立自行复制，随细胞的分裂转移到子代；也可通过接合或其他方式将质粒传递给无质粒的细菌。质粒有大小两类，大质粒可含有几百个基因，占染色体的1%～10%，小质粒仅有20～30个基因。质粒不是细菌生长所必需的，失去质粒的细菌仍能正常存活。与细菌致病性有关的质粒有：

1. F质粒

F质粒也称“致育质粒”（fertility plasmid），与某些细菌的准性生殖有关。带有F质粒的细菌为雄性菌（F+），能长出性菌毛；无F质粒的细菌为雌性菌（F-），无性菌毛。当F+和F-菌杂交时，F+ 菌性菌毛末端与F-菌表面受体接合，两菌得以靠近，形成通道，F+菌的质粒DNA中的一条链断开并经通道进入F-菌内，一条链留在自体内。两菌细胞内的单股质粒DNA通过复制，形成各自完整的F质粒。因此，供体菌虽转移F质粒但并不失去，受体菌获得F质粒后长出性菌毛，成为F+菌（图3-1）。

F质粒进入受体菌后，能单独存在和自行复制。在一定条件下，有的F质粒也可整合到受体菌染色体中，随染色体一起复制。整合后的细菌能高效地发生基因转移，故称为高频重组菌（high frequency recombinant，Hfr）。在Hfr中，F质粒结合在染色体的末端。当Hfr与F-杂交时，首先从Hfr菌染色体伸出一股DNA链，通过性菌毛介导进入F-菌。在Hfr的DNA转移中，可有不同长度的供菌染色体片段进入F-菌进行重组，但F-菌获得F质粒的机会是很少的，因它位于染色体末端，最后进入F-受体菌。Hfr菌中的F质粒有时会从染色体上脱离下来，终止其Hfr状态。F质粒与致病性的关系在于它除了携带编码菌毛的基因外，该质粒上可能常常还携带有编码毒素与耐药性基因。

2. R质粒

R质粒即耐药质粒（resistance plasmid），它由耐药传递因子（resistance transfer factor，RTF）和耐药决定子两部分组成。这两部分可以单独存在，也可结合在一起。但单独存在时不能发生质粒的接合性传递。RTF的功能与F质粒相似，可编码性菌毛，介导接合转移；耐药决定子编码对抗生素的耐受性（图3-2）。

R质粒决定耐药的机制是：①使细菌产生灭活抗生素的酶类，如β-内酰胺酶能随水解青霉素、头孢菌素等的β-内酰胺环使其失去作用；②R质粒控制细菌改变药物作用的靶部位，如链霉素和红霉素的结合靶位分别是细菌核糖体的30S和50S亚基，R质粒可编码甲基化酶，使药物作用靶位上的氮原子甲基化，因而药物不能和核糖体结合，也就不能抑制菌体蛋白的合成；③R质粒可控制细菌细胞对药物的通透性，如R质粒能编码新的蛋白质，阻塞细胞壁上的通水孔，使抗生素不能进入菌体内。

3. 毒力质粒

毒力质粒（virulence plasmid）也称Vi质粒，编码与细菌致病性有关的毒力因子。如致病性大肠埃希菌产生的耐热性肠毒素是由ST质粒编码的，不耐热肠毒素是由LT质粒编码的。细菌黏附、定植在肠黏膜表面是由K质粒决定的。某些金黄色葡萄球菌产生的表皮剥脱性毒素也是由该菌携带的毒力质粒编码的。表3-1列出了常见毒素编码基因所在位置。

此外，细菌素质粒编码各种细菌的细菌素。如Col质粒编码大肠埃希菌大肠菌素。代谢质粒编码产生相应的代谢酶，如沙门菌发酵乳糖的能力通常是由质粒决定的。有人报道发现了编码产生H2S、脲酶及枸橼酸盐利用酶的质粒。

质粒作为染色体外的一种遗传因子，普遍存在于真核和原核微生物细胞中。细菌中由于质粒的存在，有利于细菌的生长、侵袭、感染和致病，给诊断、预防和防治增添了困难。对质粒的研究，可以帮助我们了解流行菌株之间的联系，进一步分析产毒性菌株与非产毒性菌株的遗传关系（表3-1）。

三、噬菌体与致病性

噬菌体（bacteriophage）是寄生于细菌等微生物体内的一类病毒，它只能在活的敏感宿主细胞内才能增殖。噬菌体有较严格的宿主特异性，其特异性取决于噬菌体的吸附结构和受体菌表面受体分子结构的互补性。

噬菌体分为毒性噬菌体（virulent phage）和溶原性噬菌体（lysogenic phage）。溶原性噬菌体的核酸可以整合到细菌染色体中，成为前噬菌体（prophage）。与细菌的致病性有关的主要是溶原性噬菌体。溶原性噬菌体侵入细菌后，将其核酸整合到细菌的染色体上，并随着细菌的分裂传给子代菌，成为溶原状态。某些前噬菌体可导致细菌基因型和性状的改变，这称为溶原性转换（lysogenic conversion）。如白喉棒状杆菌带有β-棒状杆菌噬菌体核酸时，便能产生外毒素。肉毒杆菌的肉毒毒素、溶血性链球菌的红疹毒素的产生均与溶原性转换有关。表3-1列出了一些由噬菌体编码的常见毒素。沙门菌、志贺菌等抗原结构和血清型别也受溶原噬菌体的控制，若失去前噬菌体则有关性状也会发生改变。

噬菌体还可导致局部微生态的变化，噬菌体的存在，可能会影响到相应的宿主菌的分布。如在一段时间内，一些烧伤、创伤感染患者中，感染菌主要为铜绿假单胞菌。但在另一段时间内，铜绿假单胞菌的检出率会很低，这可能与噬菌体的存在，杀灭了铜绿假单胞菌，导致局部微生态变迁有关。

四、转位元件与致病性

转位元件（transposable element）是存在于细菌染色体、质粒或噬菌体基因组中的DNA分子上的一种可转座核苷酸片段，它能在DNA分子中移动，改变它们在基因组的位置，能从一个基因组转移到另一个基因组中。转座元件广泛存在于原核和真核细胞中，由美国遗传学家Barbara MeClintock首先在玉米中发现，并荣获1983年度诺贝尔奖。原核生物中的转座元件有两种类型：插入顺序（insertion sequence，IS）及转座子（transposon，Tn）。IS和Tn有两个重要的共同特征：一是它们都携带有编码转座酶（transposase）的基因，转座酶是位置转移即转座（transposition）的功能性酶；另一共同特征是它们的两端都有反向末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR）。

IS是最简单的转座元件，分子大小范围在250～1600bp左右，只含有编码转座所必需的转座酶的基因。它们分布在细菌的染色体、质粒以及某些噬菌体DNA上。Tn比IS分子大，长度一般超过2kb。除了它的两端带有插入序列IS，介导转座功能外，Tn分子的中央序列携带有特殊基因，如抗生素抗性基因、抗重金属基因、乳糖发酵基因、毒素基因及其他结构基因等。

有人将某些溶原性噬菌体（如Mu、D108）也看作是转座元件。Mu噬菌体是一种以大肠埃希菌为宿主的温和噬菌体，全长约39kb，可以看作是最大的转座子。如果转座是以噬菌体全基因组作为一个整体进行的，就是如上所称的溶原性转换。

转位元件在微生物致病性中的意义在于：它可以介导微生物的毒力基因在微生物基因组内部以及在不同基因组之间，尤其是细菌、噬菌体及质粒之间的水平转移。这就导致了细菌致病基因的多样性，致病基因多样性是生物多样性的重要表现。也导致了所谓致病菌与非致病菌、人体正常菌群与病原菌之间界限的模糊性。这给临床疾病的诊断、治疗与预防带来了严峻的挑战。