人参与西洋参、竹节参

【来源】

人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎，西洋参（花旗参）为同科植物西洋参P.quinquefolius L.的干燥根，竹节参为同科植物竹节参P.japonicus C.A.Mey.的干燥根茎。

人参主根呈纺锤形或圆柱形，长3～ 15cm，直径1～ 2cm。表面灰黄色，上部或全体有疏浅断续的粗横纹及明显的纵皱，下部有支根2～ 3条，并着生多数细长的须根，须根上常有不明显的细小疣状突起。根茎（芦头）长1～ 4cm，直径0.3～ 1.5cm，多拘挛而弯曲，具不定根（艼）和稀疏的凹窝状茎痕（芦碗）。质较硬，断面淡黄白色，呈粉性，形成层环纹棕黄色，皮部有黄棕色的点状树脂及放射状裂隙。或主根多与根茎近等长或较短，呈圆柱形、棱角形或人字形，长1～ 6cm。表面灰黄色，具纵皱纹，上部或中下部有环纹。支根多为2～ 3条，须根少而细长，清晰不乱，有较明显的疣状突起。根茎细长，少数粗短，中上部具稀疏或密集而深陷的茎痕。不定根较细，多下垂。具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智的功效。用于体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴、内热消渴、气血亏虚，久病虚羸，惊悸失眠，阳痿宫冷。

西洋参呈纺锤形、圆柱形或圆锥形，长3～ 12cm，直径0.8～ 2cm。表面浅黄褐色或黄白色，可见横向环纹和线形皮孔状突起，并有细密浅纵皱纹和须根痕。主根中下部有一至数条侧根，多已折断。有的上端有根茎（芦头），环节明显，茎痕（芦碗）圆形或半圆形，具不定根（艼）或已折断。体重，质坚实，不易折断，断面平坦，浅黄白色，略显粉性，皮部可见黄棕色点状树脂道，形成层环棕黄色，木部略呈放射状纹理。具有补气养阴清热生津的功效。用于气虚阴亏，虚热烦倦，咳喘痰血，内热消渴，口燥咽干。

竹节参略呈圆柱形，稍弯曲，有的具肉质侧根。长5～ 22cm，直径0.8～ 2.5cm。表面黄色或黄褐色，粗糙，有致密的纵皱纹及根痕。节明显，节间长0.8～ 2cm，每节有1凹陷的茎痕。质硬，断面黄白色至淡黄棕色，黄色点状维管束排列成环。具有散瘀止痛，消肿止痛、祛痰止咳，补虚强壮的功效。用于痨嗽咳血，跌打损伤，咳嗽痰多，病后虚弱。

人参自古受东方医药学者重视，而近年研究人参的各种生化机理的成果也不少，所以基因数据库（GenBank）内存有大量DNA序列，其中整个叶绿体DNA序列已公开，研究人员可从中查阅数据，用作设计特异性引物或探针。人参属珍贵药材，具经济价值，有多种伪品或替代品充斥市场，例如其他人参属植物包括三七P.notoginseng、羽叶三七（珠子参）P.major和三叶参P.trifolius，商陆科植物商陆Phytolacca acinosa、紫茉莉科植物紫茉莉Mirabilis jalapa、桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorus以及马齿苋科植物土人参Talinum paniculatum等。

【分子鉴定技术】

一、AP-PCR和RAPD

Shaw等（1995）以RAPD及AP-PCR对3种人参属植物及其伪品进行测试（表5-2-1a）。将RAPD和AP-PCR图谱结果输入分析软件，计算物种间的相似度（Similarity Index，SI），发现人参和西洋参的SI值最高。使用OPC5引物得出RAPD图谱（图5-2-1），样本包括人参、西洋参及三七种间的图谱各有差异，但种内一致。以TCS反向引物所得的图谱显示（图5-2-2），包括3种人参属植物（人参、西洋参及三七）及其伪品的样本，所有品种都各具独特图谱。在市场上收集8种人参产品，使用6种AP-PCR引物来鉴定，对比人参的特征谱带，从而确定样本的品种来源。该8种产品再以HPLC化学方法验证，跟AP-PCR相互比对下，两种方法的结果吻合，证明AP-PCR的可靠性高。

马小军等（1999）用RAPD分析野生人参的多态性（表5-2-1b）。样本包括7个来源地不同的野山参和1个园参样本。经筛选后发现其中14个随机引物具多态性，共扩增111条谱带，当中76条是多态的。将西洋参以同样方法分析，然后绘制亲缘关系树，能明显将人参和西洋参区分。

任跃英等（2005）对人参植物栽培品系（黄果人参、红果人参）与西洋参植物栽培品系（黄果西洋参及红果西洋参）进行的RAPD图谱分析（表5-2-1c）。共采用15个随机引物，得出131条谱带，其中14个引物的谱带有多态性。尤其4条引物在4个组别（红果人参、黄果人参、红果西洋参、黄果西洋参）具有多态性，可作鉴定之用。

二、AFLP

Ha等（2002）使用AFLP进行人参和西洋参的鉴定（表5-2-2a）。用限制性内切酶Eco RⅠ及MseⅠ将基因组DNA酶解，然后加入Eco RⅠ接头、MseⅠ接头以及连接酶，将片段两端各连上不同的接头。在预扩增反应中，使用预扩增AFLP引物Eco RⅠ+A及MseⅠ+C，退火温度56℃，得到预扩增产物。在选择性扩增反应中，以预扩增产物作为模板DNA，加入选择性AFLP引物Eco RⅠ和MseⅠ，发现Eco RⅠ-AGG与MseⅠ-CAA这对引物不单可用于鉴定人参与西洋参（图5-2-3，图5-2-4），甚至可用来区分不同产地的人参样本。将指纹图谱输入分析软件包，计算出中国和韩国产的人参的SI值较高（0.88～ 0.99），但不同产地的西洋参，其SI较低。对韩国汉川产人参样本的一个多态性谱带进行测序，于NCBI数据库检索后，发现片段含8个22bp的微卫星重复序列。根据这22bp序列合成引物，并对人参及西洋参的总DNA进行PCR扩增，结果得出多条大小由800～ 1600bp的谱带。微卫星重复序列大概10～ 60bp，研究显示重复序列常位于染色体的尾端，或与DNA复制的滑脱、移位有关。这些串联重复序列可作为杂交技术的指纹图谱探针。

罗志勇等（2000）同样以AFLP构建人参、西洋参和引种西洋参的基因组图谱（表5-2-2b）。限制性内切酶和接头同样是Eco RⅠ和MseⅠ，只是选择性AFLP扩增反应的引物不同（和），其中Eco RⅠ端的引物（Eco RⅠ-AA）比前述Eco RⅠ-AGG少了一个碱基，且A变换G，而MseⅠ-CAG比前述MseⅠ-CAA变换一个碱基（G替代A）

三、DALP

Ha等（2001）对不同产地的人参和西洋参进行DALP分析（表5-2-3a），共测10个引物，最后确定选择性引物DALP001及反向引物DALPR1为最佳组合。为减少因反向引物变短而带来的背景干扰，将退火温度调整至55℃，就能产生独特清晰的指纹图谱（图5-2-5）。在众多的谱带中，选取人参多态性谱带Pg636进行测序。谱带全长636bp，根据谱带序列在两端设计人参特异性引物Pg.F及Pg.R，退火温度70℃。使用该对引物对人参及西洋参的总DNA进行PCR扩增，发现所有人参样本均出现一条636bp的谱带，而西洋参样本则为空白。经比对基因数据库（GenBank），发现Pg636上184～ 198nt位置有5组三核苷酸微卫星重复序列（CAT）。将序列其中2～ 62nt及70～ 115nt翻译成蛋白质然后比对，发现其氨基酸序列跟伞形科欧芹Petroselinum crispum的相似度分别达71%和80%。

王琼等（2004）建立10个野山参、4个栽培人参及1个移山参的DALP图谱，寻找样本之间的特异性差异（表5-2-3b）。共筛选“选择性引物”与“反向引物”各2个。经优化条件后，得知配合selective 01及reverse 03引物进行PCR扩增便可获得最清晰的图谱。结果显示其中9个野山参样本均有一条约250bp的特异性谱带，3个栽培品和1个移山参在约200bp位置上出现一条谱带，但野山参却是空白。根据DALP图谱，发现野山参的多态性比栽培品高，而栽培品和移山参差异不大，证明两者亲缘关系接近。

四、PCR-RFLP

Fushimi等（1997）将人参、西洋参及竹节参的18S rRNA基因序列以软件分析其所含内切酶点，发现限制性内切酶BanⅡ和DdeⅠ能区分三种参类（表5-2-4a）。人参的18S rRNA上共有3个BanⅡ限制性位点，而竹节参和西洋参比人参多出1个（492～ 497nt）。在BanⅡ酶切后，图谱上人参只有三条谱带（258bp、560bp和991bp），而竹节参及西洋参则有四条（258bp、482bp、499bp和560bp）。因此BanⅡ可将人参从西洋参和竹节参中区分出来。另一方面，三者的18S rRNA上都有6个位置相同的DdeⅠ限制性位点，但西洋参比人参和竹节参在495～ 499nt多出1个DdeⅠ限制性位点。图谱上人参和竹节参出现7个片段，而西洋参则有8个片段，其中6个片段长度相同，人参和竹节参的第7个片段长度为845bp，而西洋参因在该位片段内有一个DdeⅠ限制性位点，所以变成95bp及750bp两个片段。因此，限制性内切酶BanⅡ或DdeⅠ可用作3种人参属植物和参类药材的PCR-RFLP鉴别分析（图5-2-6）。

马小军等（1998）结合RAPD和RFLP两项技术，对3种人参农家品系（大马牙、二马牙和圆膀圆芦）进行分析（表5-2-4b）。经筛选不同随机引物后，选择了OPY-09和OPK-18扩增，OPY-09得到2条分别是960bp和600bp谱带，OPK-18则只有一条600bp谱带。然后用限制性内切酶RsaⅠ、AluⅠ、MspⅠ分别对两者的产物进行酶切，其中OPK-18比OPY-09多用一种限制性内切酶Hin fⅠ。结果发现3个人参品种的图谱均是相同的。

Ngan等（1999）比较人参、西洋参、紫茉莉和商陆等4个受测品的ITS区域后，发现其中存在不同的内切酶位点（表5-2-4c）。使用引物18d和28cc进行PCR扩增，然后分别用限制性内切酶Hin fⅠ、TaqⅠ及Sau3A进行酶切。结果显示4个受测品种都有其特异性图谱，本技术可轻易将4者区分。通过测试该技术的灵敏度，即将不同比例的人参和西洋参混和（1∶1、3∶7、1∶9），重复以上程序。结果显示数量低至10%的人参亦能以此法检测。

五、ARMS

Fushimi等（1997）对人参、西洋参及竹节参进行ARMS分析，比较三者的18S rRNA序列，然后在481～ 499nt（或501nt）位置上，设计3个种特异性正向引物Pgin481F、Pjap481F和Pqui481F（表5-2-5a），分别对应人参、竹节参和西洋参的碱基替换，反向引物为18SR。用人参特异性引物Pgin481F进行PCR扩增，只有人参产生1个1329bp的片段（图5-2-7A）。用西洋参特异性引物Pqui481F时，只有西洋参产生1个1329bp的片段（图5-2-7B）。但用竹节参特异性引物Pjap481F进行PCR时，西洋参和竹节参都出现扩增片段。因此对Pjap481F引物的PCR特异扩增条件进行优化，采用这种改进的PCR条件，西洋参的DNA未产生扩增片段（图5-2-7C）。由此可见PCR的条件及所设计的种特异性引物在ARMS分析的重要性。

六、SCAR

Wang等（2001）使用OPC20（ACTTCGCCAC）引物对人参及西洋参进行RAPD分析，找出西洋参特异性谱带（RAPDAG）并对其进行测序。根据序列结果设计两对SCAR引物，分别是SCAR.F1和SCAR.R1以及SCAR.F2和SCAR.R2（表5-2-6a）。第一对引物所扩增的谱带为350bp，第二对则是419bp。对8个不同产地的人参样本，经两对引物扩增后，所得谱带都比西洋参的短了25～ 30bp。此外，亦尝试运用SCAR.F1和SCAR.R1引物对其他人参属植物如竹节参、三叶人参、三七以及人参伪品紫茉莉和商陆进行SCAR鉴别（图5-2-8），其图谱都与人参和西洋参的截然不同。比较使用的RAPD及SCAR引物，便发现后者比前者长，所以可靠性及准确性比RAPD高。

除了RAPD外，其他技术所得的谱带也可转化成SCAR。Choi等（2008）对竹节参、西洋参及人参进行AFLP分析，发现选择性AFLP引物Eco RⅠ-TA和MseⅠ-GTT能产生15条竹节参特异性谱带，对谱带JG14进行克隆及测序，总长度为293bp。依据序列设计引物JG14F和JG14R（表5-2-6b）对竹节参扩增后，会得出一条191bp的谱带，但对人参、西洋参和三七等均不能扩增，从而到达鉴别目的。

七、SNP

宋沁馨等（2009）比对人参和西洋参两者的ITS和5.8S rRNA序列，发现序列上的252nt和430nt出现SNP位点。以此差异设计出公共引物P1、人参特异性引物ASA-1和西洋参特异性引物ASA-3（表5-2-7a）。同时设计两条人工错配引物（人参ASA-2和西洋参ASA-4）。特异性引物和人工错配引物的区别在于3’末端倒数第3个位置，改为1个不匹配碱基，用以抑制错配现象。加入公共引物P1、人参特异性引物ASA-1、西洋参特异性引物ASA-3和其他PCR试剂。当加入人参模板DNA时，会跟公共引物和人参特异性引物互补，人参扩增片段为252bp，西洋参的是430bp。将人参和西洋参以不同比例混合，结果表明可测出低至5%的掺杂品种。当未加入人工错配引物ASA-2和ASA-4时，检测结果会出现2条谱带，证明所设计的人工错配引物能有效阻止非特异性扩增。

八、ALM-ASA

宋沁馨等（2008）选择人参和西洋参ITS和5.8S rRNA序列2个SNP特异点以ALMASA方法鉴定人参和西洋参（表5-2-8a）。第一步以预扩增引物S1和A1进行扩增。第二步是用限制性内切酶将扩增物切成多段，其中一个酶切点位于两个SNP之间，因此该2个SNP位点分别位于2条酶切片段之中。第三步加入适配器及连接酶，连接酶会将片段的两端都连上适配器。适配器的其中一端含HaeⅢ切口粘性末端，另一端是一长一短的碱基链（称长臂和短臂），长臂比短臂多出的碱基，其序列跟公共引物Pu是相同的，所以Pu在PCR过程中不能跟长臂结合，只有当长臂的互补区域被伸延后，Pu才可与之结合然后被用作扩增。第四步进行PCR扩增，加入扩增用公共引物Pu，人参特异性引物ASA-1、西洋参特异性引物ASA-2以及PCR试剂。ASA-1和ASA-2的3’末端位于SNP位点，在3’末端倒数第三个位为一不匹配碱基，用作加强引物的特异性。当PCR扩增时，特异性引物只会跟相关的SNP位点融合，然后伸延至配适器的长臂序列。当长臂的互补区域出现后，公共引物Pu便会跟区域结合，然后进行反方向的伸延，所以SNP点与配适器这一段区域便会不断扩增。相反，如果特异性引物未能跟SNP融合，那么将无法进行PCR。人参和西洋参的扩增谱带分别是249bp及111bp。如果混合人参和西洋参，便会得两条谱带。之后依此法设计三七及竹节参的特异性引物，分别得到长度是245bp和149bp的谱带。因此ALM-ASA方法可以对人参、西洋参、三七、竹节参等进行鉴别。

九、DNA测序

Fushimi等（1996）对3种人参属植物人参、西洋参、竹节参的18S rRNA区域进行扩增，引物为18S F和18S R（表5-2-9a），序列长度均是1809bp，三者的序列相似度高达99.8%，只在497、499、501和712位置上发现碱基替换。药材和原植物序列相同。另外，对2个人参生药样本、2个竹节参植物标本进行序列测定，发现它们之间没有差异，因而表明18S rRNA基因序列在人参属植物和参类药材是稳定的，与栽培环境无关。在3种人参属植物18S rRNA基因序列中，碱基替换集中在500nt位置左右。通过与其他种rRNA基因序列同源性检索，结果显示与西红柿Solanum lycopersicum、大豆Glycine max同源性最高，达97.4%。

Fushimi等（1997）对3种人参属植物人参、西洋参、竹节参的mat K区域进行扩增，引物为matK AF和matK 8R（表5-2-9a），序列长度均是1259bp，人参与竹节参的序列完全相同，而西洋参仅在第102nt位置发生一个碱基转换，由A转成T。

Ngan等（1999）对人参、西洋参、三七、竹节参、羽叶三七、三叶参、紫茉莉以及商陆ITS进行测序检测，所用引物为18d和28cc（表5-2-9b）。对于5.8S rRNA基因，6个人参属植物相似度达98.8%～ 99.4%，其中竹节参和羽叶三七的序列则是相同的。而在ITS序列，6个人参属品种和2个伪品的相似度只有62%，而6个人参属之间的相似度达92.8%～ 99.4%，因此可轻易区分。

十、DNA芯片

Zhu等（2008）设计一个DNA芯片用作快速区分8个人参属品种，他们选定18S rRNA作为设计探针的DNA部位，经比对8个人参属和1个五加属品种的序列后，发现利用当中的11个差异点，便可将所有受测品种区分。按照这些差异点，设计出33个特异性探针（表5-2-10a），并加上1个阳性和1个阴性对照探针。阳性对照探针长度为27bp，在8个受测人参属植物的18S rRNA上都存在，因此，所有人参属植物都会发出讯号。阴性对照探针长度25bp，是一个随机设计探针，理论上该位置不会发出任何讯号。33个特异性探针长度介于23～ 26bp，差异点置于探针的中间。按照差异点在18S rRNA上的出现位置，顺序将探针点样，固定在芯片上，而每个探针会重复点样3次，以确保所得讯号可靠。首先利用引物18S 5’F和18S 800R 5’将部分的18S rRNA区域扩增，纯化后进行修饰，于PCR产物末端加上荧光标记物Cy5。之后加入杂交缓冲液，然后置于DNA芯片上，在68℃环境下杂交2小时，之后进行清洗，扫描影像，最后以软件分析。结果显示所有人参属品种，都会在相对应的位置上发出讯号，实验证明DNA芯片能快速区分不同人参属植物。另外对5个人参属商品进行检测，发现2个是人参，2个是西洋参，1个是三七。所有样本的检测结果，都与其标识成分吻合，之后再以HPLC测试，两者结论相同。

十一、LAMP

Sasaki等（2008）比较人参及竹节参两者的18S rRNA区域后，发现序列上第497及501 nt位置上出现差异，于是在401～ 600nt之间设计6个引物（表5-2-11a），包括4个LAMP引物PG-F3、PG-B3、PG-FIP、PG-BIP和2个loop引物PG-LF、PG-LB。PG-FIP和PG-BIP的5’端的第一个碱基只会与人参的第501和497点互补，但与竹节参则不能。加入受测人参模板DNA和其他试剂，置于63℃培养60min。在扩增反应时，释放出的焦磷酸离子（pyrophosphate ion）会和试剂中的镁离子结合，令试剂变成混浊。相反，当加入竹节参的模板DNA，因为引物PG-FIP和PG-BIP的5’端不能与竹节参模板DNA互补，所以无法进行扩增，试剂最后是清澈的。因此研究加入不同浓度的人参的模板DNA，结果表明，浓度越高结果显示越快，而检测灵敏度达0.5ng。只要引物设计合适，LAMP技术比其他PCR为基础的方法更加方便快捷。

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