中药分子鉴定技术与应用
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下篇 各论

第五章 根与根茎类中药

八角莲与桃耳七(鬼臼)

【来源】

鬼臼为小檗科植物八角莲Dysosma versipellis(Hance.)M.Cheng ex Ying的根茎或同科植物桃耳七Sinopodophyllum hexandrum的根与根茎。

八角莲根茎呈横生结节状,长6~ 10cm,直径约7~ 15mm,表面棕黑色。质硬而脆,易折断,断面黄绿色,角质。气微,味苦。具有清热解毒,化痰散结,祛痰消肿的功效。用于痈肿疔疮,瘰疬,咽喉肿痛,跌打损伤,毒蛇咬伤。

桃耳七根细长,长15~ 25cm,直径约2mm,表面浅棕色,有细纵皱。质硬而脆,易折断,断面黄白色。气腥,味苦。具有和血止血,解毒消肿的功效。用于治疗风湿疼痛,咳喘,胃痛,跌打损伤。

目前市场上“鬼臼”类药材除八角莲、桃耳七外,其他多种八角莲属Dysosma植物,如贵州八角莲D.majorensis、六角莲D.pleiantha、秕鳞八角莲D.furfuracea、川八角莲D.veitchii等根茎也有混用,由于八角莲和桃耳七的形态和化学成分都十分相似,常规方法难以鉴别。

【分子鉴定技术】

一、RAPD

Fu等(2000)对八角莲属5种植物(八角莲、贵州八角莲、六角莲、秕鳞八角莲、川八角莲)7个样品进行RAPD分析(表5-1-1)。选取42个随机引物进行RAPD筛选,有12个引物扩增出多态性条带,可区分不同产地八角莲样品以及贵州八角莲、六角莲、秕鳞八角莲和川八角莲样品。其中,八角莲样品种内的RAPD多态性较低,而5个不同种间的RAPD多态性较高。结果表明,RAPD技术可以有效地鉴定5种八角莲属植物。

二、PCR-RFLP

Gong等(2006)对桃耳七和6种八角莲属植物(八角莲、贵州八角莲、六角莲、川八角莲、云南八角莲D.aurantiocaulis、小八角莲D.difformis)进行叶绿体trn T-trn L基因间隔区测序分析(表5-1-2)。发现7个种的trn T-trn L间隔区序列排列长度有1200bp,应用一对特异性引物(A49291和B48557)进行PCR扩增,桃耳七有一个900bp片段,小于八角莲属植物(1000 bp),因此特异性PCR技术可以区分两者(图5-1-1)。同时八角莲属植物之间序列差异主要有21bp、35bp、21bp等3个片段插入或缺失,而六角莲在380~ 410nt上有一个16bp缺失,云南八角莲在540~ 560nt有一个11bp缺失(图5-1-2)。

在叶绿体trn D-trn T区域发现了2个种特异性的RFLP分子标记,即HinfⅠ,DdeⅠ酶解位点,前者酶解后产生3个100~ 200bp片段(A-C酶解类型),后者酶解后有2个100~ 200bp片段(D-E类型)(图5-1-3)。其中Hin fⅠ酶解图谱显示桃耳七(A型)和川八角莲(C型)分别有一个独特的酶解类型,而其他八角莲属植物为B型。DdeⅠ酶解图谱显示桃耳七(D型)为一个独特的酶解类型,而其他八角莲属植物为E型。以上研究结果表明,通过trn T-trn L的间隔区序列及其限制性片段分析可以鉴别市场上鬼臼(八角莲属和桃耳七)药材。

图5-1-1 桃耳七和八角莲属6个种的叶绿体trn T-trn L基因间隔区的PCR产物凝胶电泳图谱(图谱源自Gong等,2006)

1~ 6:桃耳七;7~ 10:八角莲;11:云南八角莲;12:小八角莲;13:六角莲;14:川八角莲;15:贵州八角莲。M:100bp分子标记物。箭头显示900bp和1000bp的DNA片段

图5-1-2 桃耳七和6种八角莲属植物trn T-trn L基因部分序列比较(源自Gong等,2006)

“-”表示排列间隙,数字表示碱基位点

图5-1-3 桃耳七和6种八角莲属植物PCR-RFLP图(图谱源自Gong等,2006)

:Hin fI酶切图,为3个酶解类型(A-C);Ⅱ:Dde I酶切图,为2个酶解类型(D-E)1~ 6:桃耳七;7~ 10:八角莲;11:云南八角莲;12:小八角莲;13:六角莲;14:川八角莲;15:贵州八角莲。M:200bp分子标记物

【参考文献】

1.Fu RZ,Shaw PC,Wang J,et al.RAPD Differentiation of five medicinal Dysosma species.J Chin Pharm Sci(中国药学),2000,9:57-60

2.Gong W,Fu CX,Luo YP,et al.Molecular identification of Sinopodophyllum hexandrum and Dysosma species using cpDNA sequences and PCR-RFLP markers.Planta Med.2006,72:650-656

表5-1-1 RAPD应用例子的样本及技术参数

表5-1-2 PCR-RFLP应用例子的样本及技术参数