第四节　中药分子鉴定技术专利简介

专利能在一定程度上反映研究的重点领域、技术的发展状况及未来趋势，因此，掌握国内外中药的相关专利情况对于了解其发展情况有重要意义。傅俊英和曹燕（2010）对1976—2009年间美国专利商标局（USPTO）公布的核准中医药相关专利信息进行了深入分析，在美国专利库检索到中医药领域相关专利308件，再通过人工筛选，最后确定其中289件与中医药密切相关。其中分析美国授权的中医药相关专利的发明人情况发现：本书主编之一（毕培曦）作为发明人发明了相关专利共4项，居世界第5位。

作为一种创新型的科学手段，DNA技术补充完善了传统中药材鉴别的诸多不足，因此这些技术方法具有极大的专利应用价值。本节主要以中美两国关于中药分子鉴定专利的申请和授权情况作一简介，并重点讨论、评估几种已经获得两国授权或受理的DNA技术鉴定中药专利的市场价值以及改进建议，希望分子技术在中药材鉴定专利的申请及应用中得到应有的重视。

一、专利申请步骤

在美国只对那些最新、没有出现过而且实用的发明才颁发专利证书。《美国法典》第35章第101条款（35 USC §101）规定：“任何人发明或发现任何新颖和实用的方法、机器、制品或物之组合，或新而有用之改良者，皆得依本法所定之规定及条件下获得专利。”此外，第103条款还规定“一项发明，虽然并不与第101条款所规定的已知晓或者已阐述的情况完全一致，但申请专利的内容与其现有的技术间的差异甚微，以致在该项发明完成时对于本领域具有一般技术的人员而言是显而易见的，则不能获得专利权。”

美国专利法保证专利权享有人在美国对此发明、使用、买卖权利，时限为自申请此项美国专利日起20年。美国专利分3种形式，即发明（实用）专利、外观设计专利和植物专利。其中生物技术专利大多属于发明（实用）专利。USPTO负责美国专利申请和批准（图3-7）。其申请过程包括由发明人或其授权之人提交申请表，需要一份对发明及使用的过程和方法的书面描述（权利说明书），该描述必须是全面、清晰、简洁和准确的，以便使人能够通过该描述在技术上可以使用这个发明。另外，这份申请必须描述发明人发明此专利所认为的最佳方式及需要包括最少一份声明列出被保护的专利界限。

USPTO受理部门接收申请后，会检查该申请是否符合所有申请条件，确认后发出申请号，并由另外一个申请部门进行形式审查。当USPTO相关部门完成文件处理和数据采集，会按分类号将申请分配到审查部门进行实质审查。如果申请不被接纳而申请人对裁决不服，可向专利申诉和抵触委员会提出上诉；如果申请人无法回答审查部门的决定，可选择终止有关申请。如果申请获得接纳，在收到审查通过通知和支付了相关费用后，申请人即可获得申请说明书所规定范围的发明（实用）专利。

中国专利可以通过向中华人民共和国国家知识产权局（SIPO）申请获得。与美国专利第一发明人仅是荣誉不一样，中国专利第一发明人拥有专利的所有权；在美国发明人首次公布发明到专利申请有一年保护期，而在中国通常则没有这样的一段保护缓冲时间。除去这两点差异，两国对发明专利性有相似的标准。SIPO发布的《2006年版中国专利审查指南》中对如何判断专利性使用“创造性”，而美国的准则是“非显而易见性”。《中国专利法》第22条第3款指明“创造性，是指（在专利申请前）与已现有技术比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。”

美国的发明（实用）专利相当于中国的发明专利。然而如同其他许多国家一样，中国还有一种实用新型专利，被认为“对产品的形状、构造或者其结合所提出的适于实用的新的技术方案”。尽管通常一个实用新型专利因为审查没有发明专利严格而更快通过授权，但是实用新型专利的保护期限仅有10年，而发明专利则是20年。

申请人如果希望获得多国专利保护，可以考虑申请国际专利。只要申请中指定需要获得专利保护，且向已签署《专利合作条约》（Patent Cooperation Treaty，PCT）的国家以一种规定的语言提出一次申请，就取得了向该国家申请的国际专利优先权。美国和中国都是该条约的签署国之一。申请程序分为国际审查和国家审查两个阶段，第一阶段，国际专利审查员会根据现有技术，对其发明专利性提出初步评估，以便申请人决定是否寻求发明保护。第二阶段，如果申请人在一个国家递交申请，各国专利机构根据国际专利审查意见，按照本国专利法规和程序审查，其专利仅在所申请的范围内获得授权。

二、DNA技术鉴定中药材的专利

自从1990年开始，DNA技术开始应用于中药材鉴定。出于商业化和知识产权保护的考虑，出现了许多相关专利，包括中药材DNA提取、模板DNA扩增、特定物种的DNA指纹图谱及测序、高通量检测等。现以美国和中国授权相关专利（表3-1）以及部分未能成功申请的个案（表3-2）为例，简略介绍这些专利的特点，从而了解专利审核标准。

1.核酸提取专利

核酸提取的第一步准备工作是将样品切碎或磨细。传统方法一般用化学品、超声波、机械或高压粉碎，有时还会用液氮和研钵去磨碎药材。这些方法大多花费大量人力、财力和物力，所得甚少。为了加速和简化这一过程，Weeden等人发明了一种创新的“板模研磨”（matrixmill）方法（美国专利6063616），这种方法可提取多种样品DNA。把样品放进96孔板中，然后加入一个中心为金属、外层为惰性材料所制成的小磨棒，将孔板放入模块研磨器后通电，通过磨棒转动研碎样品。其原理与研钵研磨相同。测试结果显示该发明成功从豌豆、黄豆、黄瓜、辣椒和西兰花提到DNA，每次操作可同时处理多达96个样品，而所得高质量DNA可用于PCR实验。我们建议在给这个发明装置上加装冷却设备，可更有效避免DNA和RNA在提取过程中被降解，同时应进一步缩小磨棒体积至适用于384孔板，使样品处理量增加3倍。

DNA鉴定技术的其中一个先决条件，是模板DNA必须要完整而纯净。常规DNA提取法所用的提取缓冲液，含有缓冲离子、螯合剂（表面活性剂）和蛋白酶类等成分。螯合剂如EDTA可以结合游离2价离子，可以减少核酸酶的活性，从而避免DNA在提取过程中被降解；蛋白酶K是一种依赖Ca离子的酶，可以降解细胞组织和细胞膜，因而提高DNA提取率。但是，将EDTA和蛋白酶K同时加入提取液中，会因EDTA的作用令Ca离子浓度降低，间接令蛋白酶K不能发挥正常功效。Weber等人设计了一种无需螯合剂的提取液，令蛋白酶K可在最佳环境下工作，这种提取液特别适合用于蛋白质含量高的动物细胞，这个发明已获得了美国专利（7214484）。我们建议除了针对螯合剂外，亦可改良蛋白酶K，甚至改用不依赖2价离子的蛋白酶。

当细胞壁被破坏后，细胞内的DNA和其他物质会被释放到提取液中，一般提取程序会加入苯酚和氯仿这两种有机溶剂将DNA从其他杂质中分离。通过离心后会分成上下两层，DNA会停留在上层的水层中，而蛋白质等污染物会变性留在有机层，将上层液体吸出便完成分离过程。但含DNA的水层或会残留一些有机溶液，在进行PCR时苯酚类成分会影响扩增反应。为此，Thomas等人发明了一种新型的DNA提取法（美国专利5106966）。具体方法是在离心前将聚乙酯硅胶放入离心管底部，在离心作用下，硅胶把水层从有机层中分离开，并悬浮在两层之间，像屏障一样隔离有机溶剂。采用这种新方法可提高DNA提取率达40%。而且经过紫外光谱检测，DNA260/280nm比值几乎在1.8左右，说明纯化DNA完全没有受到蛋白质等污染。

2.模板DNA扩增专利

炮制或储存等过程，无可避免的会令药材中的DNA受破坏。所以，大部分的中药材DNA鉴定技术都会先通过PCR来复制足够量的DNA，才可作后续分析。PCR是一种聚合酶链反应，它可以将很微量的中药材中特定基因区域的DNA模板扩增几百万倍，因此已成为分子生物学研究中不可或缺的技术之一，被广泛用于DNA克隆和测序、分子亲缘关系、分子诊断等研究领域。自1984年Mullis博士发明PCR，美国Cetus公司获得PCR专利（美国专利4683202，此后该专利转让给了罗氏分子系统公司）以来，研究人员开发了多种相关专利技术。例如，基因准确插入编码框的直接克隆技术（美国专利5075227）；多重PCR扩增技术（美国专利5582989）；反转录PCR技术（美国专利5310652）；热启动PCR技术（美国专利5643764）等。

由于扩增抑制物和模板或引物次生结构的影响，PCR可能无法进行扩增反应而产生阴性结果。高GC含量会导致其解链温度升高，使扩增过程难度加大。一些研究人员尝试通过提高变性温度，从常规的94℃增加到98℃，或者延长变性时间来解决这一问题。然而DNA聚合酶会因长时间处于高温环境下而失去活性，为了维持其活性，有必要改进扩增反应缓冲液。Lapidot等人通过使用脯氨酸、四氢嘧啶（THP）等试剂以增强DNA聚合酶在高温下的稳定性和降低双链DNA的解链温度（美国专利7150980）。McLaughlin等人通过在PCR反应液加入山梨醇和DMSO等成分，有效降低PCR过程中非特异性扩增（美国专利6783940）。

操作人员在常温下配备PCR试剂，往往因聚合酶在未达预设温度时已开始进行非特异性扩增，导致产生非专一谱带。其中一种解决方法是采用热起动PCR，将抗聚合酶的抗体嵌合在聚合酶之上，从而抑制其活性。只有当PCR仪的反应板升至预设温度后，抗体从聚合酶上分离，PCR才会开始。但是，这种抗聚合酶的抗体非常昂贵，且只适用于一些特定的聚合酶。因此，Barnes等人发明了通过控制镁离子浓度来调节DNA聚合酶活性的方法（美国专利6403341），该发明有别于常规PCR试剂，所用的是固态镁离子混合物。在常温下，PCR试剂中的聚合酶因缺乏镁离子而丧失活性。当PCR仪反应板温度上升，镁离子从混合物中逃脱并溶入PCR试剂，待镁离子浓度达至预定水平，聚合酶才恢复活性进行扩增反应。该发明的最大优点是可将现有的DNA聚合酶提升为热起动PCR系统，而无需单独为每一种酶制造抗体，因此通用性高且开发成本低。

为了提高PCR扩增成功率，需要找到更好的DNA聚合酶或者PCR缓冲液配方。这些改进技术既可以增强DNA扩增性，也可以减少模板量，后者尤其会影响中药材DNA扩增，因为通常情况下中药材DNA提取难度较大（提取DNA有很严重的降解），且从商品药材中提取的DNA混有抑制扩增的化学物质。因此，改进DNA聚合酶活力和优化缓冲液配方可以增大扩增成功率。

3.种特异性基因序列和指纹图谱专利

市场上的一些参类产品以饮片或粉末等形式出售，单靠外形特征难以判断其品种来源，而化学分析法则可能受标准物的含量变化导致错判。王骏等人发明利用PCR-RELF指纹图谱鉴定人参与混淆品西洋参、党参方法（美国专利5876977）。由于ITS区域在不同的物种间呈高度多态性，而ITS两端的保守区域则可作通用引物设计。PCR产物通过特定的限制性内切酶消化和电泳，产生种特性RFLP片段，鉴别结果简单直观。编者（邵鹏柱）等人发明类似方法鉴定16种石斛及其伪品石仙桃Pholidota cantonensi（中国专利01102434）。

此将几种名贵药材鉴定的DNA技术专利归纳如表3-3。

除了ITS区域，5SrRNA间隔区亦被用于药材鉴定。詹华强等人应用同样的PCR-RFLP方法鉴别4种贝母属Fritillaria药用品种（美国专利6569625），PCR测序发现每种贝母的5SrRNA间隔区序列均存在差异，其中安徽贝母F.anhuiensis和蒲圻贝母F.puqiensis最为相似（序列相似度达97.48%）。PCR产物经过Eco RⅠ消化，川贝母F.cirrhosa PCR-RFLP图谱出现384bp和314bp两个片段，浙贝母F.thunbergii则出现460bp和123bp两个片段，而安徽贝母和蒲圻贝母不能被消化，图谱只有一个谱带。我们认为5SrRNA间隔是一个高变区域，某些物种基因拷贝会出现一些位点突变、插入和缺失，导致RFLP酶谱均一性较差，因此对于贝母类而言，选择ITS或者叶绿体基因作为分子鉴别标记可能更可靠。

PCR-RFLP方法也用于检测动物类药材。阿胶是用驴皮为原材料制成的中药，但市场上亦有以其他动物皮如牛皮或马皮所制的膺品，因驴皮和冒充品的蛋白质组成相似，质谱或酶标方法难以鉴别其基原。章安等人通过扩增359bp片段的细胞色素b基因，采用Hin fⅠ，HaeⅢ，AluⅠ，MboⅠ，TaqⅠ，MseⅠ等6个限制性内切酶消化该片段，从而发明了鉴定驴与马、牛和骡子等其他动物的方法（中国专利03153838）。

周开亚等人发明了鉴别中华绒螯蟹（大闸蟹）Eriocheir japonica sinensis与合浦绒螯蟹E.japonica hepuensis的试剂盒（中国专利01127215）。该试剂盒由一对特异引物和限制酶DraⅠ组成，合浦绒螯蟹DNA片段上的188nt位点会被DraⅠ切割成两个片段，而中华绒螯蟹DNA片段中没有DraⅠ识别位点，图谱上只会显示出一个293bp长度的完整片段。

冬虫夏草Cordyceps sinensis有许多掺假现象，采用形态、生化等方法都难以准确鉴定。许瑞祥和陈志升发明一种鉴别冬虫夏草与7种类似虫草菌类全新PCR-RFLP方法，自待鉴定物上提取DNA，以NS3和NS6为引物PCR扩增18S rRNA基因片段，扩增产物通过4种限制酶分别消化。根据冬虫夏草CfoⅠ酶切图谱具有570、300、50bp等3个片段，植生虫草Phytocordyceps ninchukispora亦有大小不同3个片段（830、320、150bp），蛹虫草Cordyceps militaris则有5个片段，借此鉴别冬虫夏草与其他虫草菌（中国专利99106135和美国专利6271003）。许瑞祥和陈志升进一步发明了18S rRNA基因测序鉴别冬虫夏草的方法，所有冬虫夏草都具有相同的18S rRNA基因序列，而与其他虫草菌类有差异（美国专利6251606）。DNA测序技术能提供比PCR-RFLP更多碱基排列信息，但后者操作程序简便、适合于筛选。虽然PCR-RFLP指纹图谱非常清晰明了，但是用于鉴别冬虫夏草还是存在一定的问题。一是冬虫夏草菌和昆虫蝙蝠蛾的18S rRNA都会被扩增，所以PCR-RFLP方法会给出假阳性结果。为改进此方法，有必要设计一种专门用于冬虫夏草菌类扩增引物，以排除昆虫类DNA扩增影响。二是18S rRNA基因十分保守，鉴别成功率不高，应该考虑选择核基因组多变区如ITS等基因作分子标记鉴别冬虫夏草。

随机扩增多态性DNA（RAPD）是一种简单和快速的构建DNA指纹图谱方法。鉴定未知样品，需要预先建立相关物种图谱作为对照标准，只要将未知样品图谱与标准图谱逐一对照，便能判断其基原。虽然这种方法快捷简便，但是模板DNA的纯度和质量、DNA聚合酶种类以及PCR仪型号均会影响RAPD指纹图谱。为了提高检测的准确性和可重复性，其中一个改善方法是将RAPD图谱转化为序列特异扩增区技术（SCAR）数据。例如编者（邵鹏柱）等所发明的鉴别植物药材（人参类）和动物药材（药用蛇类）SCAR方法。首先采用RAPD或直接扩增多态性长度（DALP）方法获得西洋参多态性条带，然后测序解读其中序列，根据所得资料设计几套SCAR引物，用于鉴定西洋参及其伪品（美国专利6803215）。SCAR只需要一步PCR步骤，因此较PCR-RFLP方法（美国专利5876977）更简便、有效。

张文驹等发明了鉴别野生人参与栽培人参及其伪品的DALP方法（中国专利200410016240）。据DALP多态性DNA序列设计两对引物。第一对引物只扩增栽培人参DNA，获得一个174bp扩增产物。第二对引物仅扩增300bp产物用于鉴别野生人参和栽培人参。而且这4个引物可以进行多重PCR鉴定，大大提高检测效率。

王川易等人发明了一种鉴定朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum的方法（中国专利200910136663）。先找出朝鲜淫羊藿与淫羊藿E.brevicornu、粗毛淫羊藿E.acuminamm、黔岒淫羊藿E.leptorrhizum、箭叶淫羊藿E.sagittatum、柔毛淫羊藿E.pubescens、巫山淫羊藿E.wushanense和天平山淫羊藿E.myrianthum的nad1第2内含子序列之间的差异，然后设计两对朝鲜淫羊藿特异性引物kor-aF、kor-bR以及kor-bF、kor-bR，每个扩增反应内加入其中一组引物，图谱显示只有朝鲜淫羊藿才产生一条谱带，而其余品种则显示阴性结果。

大黄有3种正品（掌叶大黄Rheum palmatum、唐古特大黄R.tanguticum和药用大黄R.officinale）。杨美华等发明了利用叶绿体间隔区trn L-F序列DNA多态性鉴别正品大黄方法（中国专利00134133）。trn L-F序列多态位点独特性在于3’-外显子上游221nt处位点如果是胞嘧啶C，则为正品大黄；如果是腺嘌呤A则为伪品，由此设计一对特异性引物，通过SCAR方法，3种正品大黄产生一条独特的300bp带，而其他10种伪品却显示了阴性结果。采用类似原理鉴别天麻Gastrodia elata和混杂品泽兰Lycopus lucidus的发明也获得中国专利（200510031346）。

张丽华等人发明了能鉴定3种易混淆中药的试剂盒（中国专利200810051642）。首先对线粒体DNA中的细胞色素b测序，根据所得序列设计特异性引物。测试显示正品药材鹿鞭、贝母和防己经PCR扩增后，会分别得到320、280及300bp的谱带，而混淆品牛鞭、贝母和防己伪品则显示阴性结果。

由于SCAR扩增条件严格，因而重复性高，鉴定结果比RAPD可靠。随着国际基因数据库收载更多的DNA序列，可以更简便获得引物设计资料。尽管测试及优化SCAR实验条件需花费一定时间，但一旦找到并设计出特异引物，鉴定未知样品就变得简单。

4.高通量检测和未知DNA鉴定专利

采用PCR-RFLP方法的基本前提是所扩增DNA序列存在酶切位点，假如序列缺少相应的酶切位点，就难以进行DNA鉴定。另一可行方法是采用DNA杂交技术，其中基因芯片因具有高通量特征而得到大力开发。关海山等人发明了一种高通量鉴定中药材的芯片（美国专利7297490）。以3种药用植物（梅叶冬青Ilex asprella、大叶冬青I.latifolia和铁冬青I.routunda）为示范，首先对3个品种的ITS进行测序及比较，确定它们之间存在差异。先以PCR扩增这些多态性的ITS-1和ITS-2区域，再将每个品种的扩增物点在尼龙膜上的特定位置，完成制备芯片程序。鉴定时，先将样品的ITS-1和ITS-2区域通过PCR扩增，并用地高辛标记将扩增产物制备成探针，然后在尼龙膜上进行杂交，使用地高辛核酸检测试剂盒检测信号。只要核对样品在尼龙膜上出现杂交信号的位置，即可判断所属冬青品种。

三、DNA鉴定专利前景

DNA鉴定中药的各类专利技术，从DNA提取方法到高通量检测，由改善试剂乃至制作药材DNA指纹图谱，其商品化的难易度各有高低。其中DNA提取和PCR反应改进的发明亦应用于现有产品，所以较其他类型容易商品化。药材DNA序列和指纹图谱专利可以用来设计检测试剂盒中的引物或DNA芯片，因而具有特别高的市场商业价值。至于检测仪器的发明，从设计转变为实物的过程中，均需要大量的可持续性投资，在这种情况下，拥有专利无疑有助发明人获得实践目标所需的资金。当然并非每项发明都具备商业开发价值，某些亦会在申请过程中被驳回而遭放弃（见表3-2）。

尽管目前中药DNA鉴定专利大多用于濒危、毒性、名贵药材，但随着市场对基原准确及高品质中药的需求持续增加情况下，DNA鉴定技术在质量监控环节必定会担当更重要角色。我们预期会陆续出现针对各种中药材鉴定的DNA专利，如果进一步改进和完善现有技术，一定会为DNA鉴定中药材提供坚实的基础。