第四节　各种分子技术的分析比较

在决定使用哪一种分子技术鉴定前，必先了解各种分子技术的优缺点。在此只简略比较以上分子技术在检测速度及简易度、特定物种鉴定能力、未知物种鉴定能力以及可重复性等4个方面，并且讨论有关技术的限制和应用范围。

一、分子技术优势比较

1.检测速度及简易度

最简单快捷的是LAMP，过程只涉及PCR，而且不须使用热循环仪，单靠肉眼就可检视结果。只要引物设计得宜，LAMP技术比其他PCR为基础的方法更方便和快捷。其次是SCAR、RP-PCR和ARMS等指纹图谱技术。PCR后，扩增产物经电泳分离，便可检视图谱，判断样本的物种来源。再次是PCR-RFLP，因为PCR扩增产物要经过内切酶消化，比前述技术多了一个步骤。第四是DNA测序和DNA芯片，皆因样本制备时间长及程序多，所以在这项目居较后位置。最繁杂的是AFLP和ALM-ASA，两者都需要酶切及核酸连接等过程，同样需要进行2次PCR。

值得注意的是以上的简单比较是已建立利用某技术的分析条件下的假设，例如应用于SCAR的特异性引物作鉴别人参（Wang等，2001）。而具体建立某技术的分析条件，往往要花巨大的人力物力。

2.特定物种鉴定能力

这里所指的特定物种，是一个已知生物品种的范围，例如只要区分3种贝母药材川贝母Fritillaria cirrhosa、甘肃贝母F.przewa lskii和浙贝母F.thunbergii等，就不必考虑其他物种。在众多技术之中，应当以生物遗传讯息量大（例如所产生的谱带数目多）和对检测全基因组的类别为最理想，所以AFLP、RP-PCR和DALP等技术在中药分子鉴定种占有优势。事实上，AFLP和RP-PCR可应用于相同物种不同群落的比较研究，可见它们都具有高分辨能力。其次是DNA测序，因为每个碱基序列都可提供一个讯息，数据量大，能区分近似品种。DNA芯片和ALM-ASA虽然可同时检测多个如SNP位点，但数据量始终不如DNA测序。其余的技术，包括PCR-RFLP、SCAR和LAMP，只会提供正或负结果，而且每次可检测的目标不及DNA芯片，所以在鉴定特定物种能力方面相对较差。

3.未知物种鉴定能力

药材鉴定往往要处理无法具体说明基原的样本。例如只知道样本是动物，但不知道是鱼类、两栖类还是鸟类。面对这种情况，所使用的技术，必须有一个标准数据库供比对未知样本，才可作出鉴定。在以上众多的DNA分子技术中，只有DNA测序可胜任。DNA测序所用的是一对通用引物，所以绝大多数的品种都能通过PCR扩增和测序，因此，理论上可分析任何样本。而测序所得的序列，可以通过和数据库的条形码比对，找出完全一样或相似度最高的物种，便能知道该样本的真正身份。虽然RP-PCR、DALP、AFLP使用的非特异性引物亦可对未知样本进行扩增，但它们都欠缺一个可作比对的数据库，所获得的图谱无法作为鉴别依据。其余的技术都需要使用特异性引物，如果未能知道样本的大概身份，是不容易设计引物的。

4.可重复性

中药材很多都经过高温炮制等处理，这些程序都会破坏样本里的DNA。如果所使用的技术易受DNA模板质量的影响，而导致每次检测结果都出现差异，会大大影响数据的可重复性。

在以上众多DNA分子技术当中，DNA测序的可重复性最高。原因是仅对基因组上某一特定区域作测序，而且扩增区域少于1000个碱基，较小受DNA质量所影响。此外，所扩增的区域大都位于叶绿体和线粒体，而这些环形结构比核基因组（核糖体）坚固，较能抵抗环境伤害。其次是SCAR、ALA-AMS、ARMS、PCR-RFLP和LAMP等指纹图谱技术和DNA芯片，因为PCR扩增条件严格，所用的引物都具高度特异性，而且只会对基因组上某一特定位置扩增，所得结果是可预计的。例如以SCAR作鉴定药材真伪时，所得的结论是由扩增谱带的有无而去判断。LAMP就以试剂是混浊还是清澈作指标。DALP和AFLP会对整个基因组的差异作出反应，而且通常会得出多于一条的谱带，所以较受DNA模板质量所影响。而重复性最低的是RP-PCR，因为PCR退火温度低、条件缓和、引物短，而且是检测整个基因组，所以最受模板DNA质量所影响。

二、分子技术的应用限制

虽然DNA技术分辨力高而且准确，但在某些情况下无法使用，或者会得出错误结果，而最具决定性的因素是模板DNA的质量。如上所述，中药材通常经产地加工或炮制而对样本的DNA造成破坏。某些分子技术虽然受影响较少（如DNA测序），但是年代久远、受各类虫害真菌侵蚀的药材，或由饮片制成的药液，因DNA量极少，并非每次都能成功进行PCR扩增。分子鉴定技术的优点是灵敏度高，但较易受环境因素污染。在分析过程中，可能会同时抽取样本和污染物的DNA，经扩增后会得出2条或以上的PCR产物。为此，部分分子技术借着加入其他工序，让样本和污染物的PCR产物得以分离。以DNA测序为例，可先将PCR产物克隆，再将所有克隆进行测序。但一些指纹图谱技术如AFLP和PR-PCR，操作人员是无法判断各谱带究竟是来自样本还是污染物的。此外，分子技术所得结果是不受生物环境和生长周期的影响的。但正因为这些特点，大部分分子技术并不适用于药材质量的优劣评价。不过，有些分子技术如AFLP、PR-PCR和DNA测序，在适当的条件下可分辨不同产地的药材，在药材地道性研究方面有其优势。

分子鉴定技术是近十几年中药材鉴定技术之中，发展速度最快的领域，随着最新最全基因组测序的简化和成本的降低，DNA序列分析将会成为未来中药分子鉴定的最重要手段。