第三节　分子鉴定方法

脱氧核糖核酸（d eoxyribonucleic acid，DNA）是生物的设计蓝图，依据此建构细胞内的分子，例如各类核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）和蛋白质（protein）等。DNA是一种聚合物，基本单位是核苷酸（nucleotide）。核苷酸由糖类、磷酸分子以及碱基组成。DNA有4种碱基，分别是腺嘌呤（adenine，A）、胞嘧啶（cytosine，C）、鸟嘌呤（guanine，G）与胸腺嘧啶（thymine，T）。每个核苷酸只含1个碱基，所以负责建构DNA分子的共有4种核苷酸。每种核苷酸依特定位置重复排列，其中的糖类分子与核苷酸的磷酸分子以化学键相连，组成长链骨架，而在这长链骨架分子里的核苷酸排列次序便是基因序列（sequence）。在细胞内，DNA大部分时间都是由两条互相配对的长链紧合，形成双螺旋结构，其中A配对T，而C配对G。

理论上，每一个生物个体的DNA序列都是独一无二的。分子鉴定技术是通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排列规律及其外在性状表现规律的技术。这些基因排列变化可大致归纳为①序列突变；②插入突变；③缺失突变；④重复单元数目突变；以及⑤单核苷酸突变。各类DNA鉴定技术就是针对这些基因排列差异而设计，并分析解读生物基因组数据，从而辨别或区分不同物种或个体。

由于DNA分子的信息量大，且不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，即每一个体的任一细胞都含有相同的遗传信息，这就使其在生物鉴定方面具备了准确性高、重现性好等特点。同时，DNA分子鉴定直接分析的是生物的基因型而非表现型，鉴别结果不受环境因素、样品形态（无论原品、粉状或片状）和材料来源的影响，因此，可为中药鉴定提供更加准确可靠的手段。分子鉴定技术的兴起和逐步成熟，使得中药材以形、色、味、质地为依据的传统质量评价方法和以形态组织学、解剖学、化学等客观指标为依托的现代质量评价方法得到了有益的补充，解决了上述方法所不能解决的问题，并呈现了长足发展的潜力和更广泛应用于中药材鉴别的趋势。

分子技术的发展使得分子鉴定成为动植物鉴定的一个大众化手段，因此也成为继四大经典鉴定方法（基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定）之后的第五大国家法定方法（2015年版《中国药典》）。

根据原理及所使用的核心技术，分子鉴定技术可分为三大类：①DNA指纹图谱技术；②DNA测序技术；及③基于PCR的高通量核酸杂交技术。本章简要概述分子鉴定技术及其分析方法在中药鉴定方面的研究现状与进展，而各种技术的原理，详见第二章。

近20年来，国内外学者在中药分子鉴定研究取得了许多新的进展。目前国内外应用分子鉴定技术对人参、石斛等植物类以及蛇类等动物类200余种中药材进行了鉴定研究，具体应用的代表性实例参见下篇各论。

一、基于PCR的DNA指纹图谱技术

指纹（fingerprinting）是鉴证专业中的重要证据，理论上每一个人（或个体）的指纹都独一无二，通过比较嫌疑人和案件现场所搜集的指纹，便可确认是否由嫌疑人所留下。这个概念可延伸到鉴定生物品种范畴上。DNA指纹图谱是一个可反映基因组DNA特征的技术。物种在进化过程中，因环境或其他因素导致基因突变，会令物种间或个体间的DNA出现差异。通过DNA指纹图谱技术将基因组特征图像化，便可获得生物DNA的“指纹”。比较各物种的特异图谱，可了解它们的相似性或差异，从而作出鉴定。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是20世纪80年代中期发明的一种无细胞的基因扩增技术。该技术的问世为现代生命科学研究开创了一个新时代。PCR借着DNA重复变性（denaturing）、复性（annealing）、延伸（extension）约20～ 40次，能在2小时内将少量的靶DNA扩增数百万倍，从而方便检核；更理想的是相关的操作具有简单、快速、特异、灵敏的特点。自此，指纹图谱技术不再受中药材DNA数量不足所限，科研人员利用PCR，接连发明了各种DNA指纹技术。较之经典的限制性片段长度多态性（RFLP）技术，这些技术有以下优点：①无须使用同位素，不受同位素半衰期的限制，并减少实验室污染；②不需大量DNA；③较少受模板DNA质量影响。

基于PCR的指纹图谱受引物（primer）和DNA模板（DNA template）之间的互补程度所影响。如果引物和模板完全互补，那么退火时两者会紧密结合，从引物起开始延伸，得出扩增的指纹谱带。部分指纹图谱技术的扩增条件严格，引物和模板如果出现错配（mismatch），则可能会导致两者无法互补结合，谱带区域没被扩增，依这种思路设计的指纹图谱技术，主要是区分不同物种之间的序列差异，例如等位基因上的碱基突变。相反，某些指纹图谱技术故意将扩增条件降低，容许出现少许错配的引物跟模板结合，所以引物可以跟基因组上多个位置互补，从而反映整个基因组的特征。

1990年William等第一次证明用任意顺序的10个碱基的寡核苷酸作单引物，以未知序列的基因组DNA为模板，通过PCR扩增可获得一组不连续的DNA片段。这种以随机引物作扩增的技术称为随机扩增的多态性DNA标记（rapid amplified polymorphic DNA，RAPD）。几乎同时Welsh和McClelland用20～ 30个碱基的任意引物，成功获得DNA指纹图谱，并命名为任意引物聚合链式反应（arbitrarily primed-PCR，AP-PCR）。1994年Zietkiewicz等针对广泛存在于真核细胞内的简单序列重复（simple sequence repeat，SSR），设计出简单序列重复区间扩增多态性（inter-simple sequence repeat，ISSR）。1995年Vos等人发明了一种集PCR和RFLP优点于一身的扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）。2001年Li和Quiros H发展了一种新型的相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism，SRAP），该标记通过独特的引物设计对开放阅读框（open reading frames，ORFs）进行扩增。

DNA指纹技术具有操作简易、灵敏度高的优点，可为中药鉴定提供更加准确可靠的手段，尤其是它可以在不知道特异DNA序列的情况下检测DNA的多态性，在目前绝大多数动、植物中药材DNA序列尚不清楚的情况下，在中药品种鉴定研究方面具有广阔的应用前景。

自我们研究小组在1994年初首次报告采用AP-PCR方法进行人参和西洋参基原鉴定以来，采用DNA指纹技术进行鉴定研究的有动物蛇类药材如乌梢蛇和金钱白花蛇、龟甲和鳖甲、海马，植物类如三七、甘草、黄芪、黄芩、枸杞、淫羊藿、贝母、石斛、黄连、苍术、山药、厚朴、金银花、西红花、金线莲等。

指纹图谱的另一长处是确认药材的来源地，即药材道地性分析。运用AP-PCR和RAPD指纹技术对中药居群、种质资源等道地性判别研究的有麻黄、厚朴、牛蒡子、苍术、泽泻、白芍、鱼腥草、党参、柴胡、麦冬、地黄、佛手、枸杞子等。

二、DNA测序技术和条形码技术

与指纹图谱将种物间的DNA序列差异以图像方式间接地呈现到图谱不同，DNA测序（DNA sequencing）是将基因片段上每一个碱基序列直接展示。

生物中某些DNA区域的序列在品种之间差异大，但在相同品种的不同个体则表现保守，包括动物和昆虫的线粒体基因组、植物和菌类中核糖体的DNA内转录间隔区序列（internal transcribed spacer，ITS）以及植物叶绿体基因组。这些物种间的序列差异，比如生物的外型、化学等特征，可用作物种分类之用。为方便检索、比较及发表各项DNA序列数据，国际上建立了多个序列数据库，收录大量数据，具体参见第三章。

利用DNA测序获得的排序结果所建构的物种亲缘关系可以用于不知名物种的鉴定。方法是对样本及已鉴定标本进行测序，然后用计算机程序绘画出分子系统树，不知名样本会跟进化差异最小的物种组成一个散群（cluster），由此判断样本的真正身份。1992年在这个逻辑上发展了一套“法证信息核苷酸测序法”（Forensically informative nucleotide sequencing，FINS）（Bartlett等，1992）。1994年进行了FINS技术优化，主要在分析序列的算法方面大量改进。由于建构分子系统树的程序往往耗用计算机大量资源，以当时的运算能力，要花很长时间才能完成。新优化方案则采用较简单的算法，只分析序列间相似程度，大大缩短分析时间（Forrest和Carnegie，1994）。

早在1995年我们小组已对6种人参属Panax植物的ITS1和ITS2区进行了序列分析，结果显示凭其序列可将它们区分鉴别（Shaw和But，1995）。到目前我们小组利用cyt-b序列可将6种蛇类药材区分开，并成功将不知名蛇肉干样本鉴定，确认当中混杂蟒蛇Python molurus及网纹蟒P.reticulatus（Wong等，2004）。使用5S rRNA鉴定于香港市场收集的红党参饮片，证实是素花党参Codonopsis pilosula var.modesta混入赤石脂（Zhang等，2007）。结合ITS和5S rRNA间隔区序列将木香Saussurea lappa（Aucklandia lappa）和其他混淆品区别开来（Chen等，2008）。以5S rRNA间隔区序列鉴定22种淫羊藿属Epimedium、獐牙菜属Swertia植物基原（Sun等，2005；Yu等，2008）。凭ITS序列差异点，成功鉴定正品白花蛇舌草Hedyotis diffusa和其他伪品。用trn L-F和trn H-psb A序列区分含马兜铃酸的马兜铃属Aristolochia植物（Li等，2010a，2010b）。对19个乌头属Aconitum植物进行trn H-psb A测序，发现可分成10组，并成功区分正品川乌A.carm ichaelii与草乌A.kusnezoffii以及其他品种（He等，2010）。应用FINS技术鉴定中药具体例子详见文献（Li等，2011b）。

2003年一个国际组织“生命条形码联盟”Consortium for the Barcode of Life（CBOL）发表声明，认为线粒体的细胞色素C氧化酶亚单位1（cytochrome c oxidase subunit 1 mitochondrial region，COⅠ）是鉴定动物和昆虫的标准序列，此生物品种鉴定方法即为DNA条形码技术（DNA barcoding）。2008年该组织又确立了叶绿体的rbc L及mat K两组基因为植物的DNA条形码（CBOL Plant Working Group，2009）。

现在，DNA测序和基因条形码鉴定已变成一种常规技术。采用DNA测序和条形码技术进行鉴定研究的还有动物类药材如鸡内金、海马、哈蟆油、鹿茸、龟甲、鳖甲、紫河车、塞隆骨，植物类如人参、竹节参、西洋参、珠子参、假人参、当归、北沙参、柴胡、山药、三七、半夏、莪术、甘草、黄芪、肉苁蓉、黄芩、枸杞、淫羊藿、贝母、砂仁、石斛、大黄、黄连、苍术、山药、厚朴、金银花、西红花、肉桂、金线莲、太子参以及广东地方特色凉茶原料等（陈士林等，2007，2011，2012；赖小平等，2010；Li等，2011a，2012）。其中，根据动物线粒体cyt-b、12S rRNA基因DNA测序结果，分别设计一对特异性引物进行乌梢蛇Zoacys dhumnades和蕲蛇Agkisrrodon acutus的分子鉴别正式收入2010版《中国药典》一部。

如果DNA测序分析结合有关化学型分析数据，还可以为物种鉴定和道地性评价提供分子依据。

三、基于PCR的高通量核酸杂交技术

生物芯片（如DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray）是一种高通量的检测平台，在小小一块生物芯片上，同时进行海量的核酸杂交实验，观察基因数据。由于中药材的生物来源极广，此技术正好为高通量鉴定开辟一条新出路。

目前采用DNA芯片技术成功鉴定研究的仅有18S rRNA基因序列特异性探针对半夏Pinellia ternata及其伪品虎掌（掌叶半夏）P.pedatisecta、人参属植物与生药（Liu等，2001；Zhu等，2008），5S rRNA间隔区和26S rRNA基因D2、D3区特异性探针对贝母属Fritillaria（李邵平等，2000；Thoi等，2003），5S rRNA间隔区和ITS2特异性探针对石斛属Dendrobium（Zhang等，2003；Sze等，2008）等几例成功鉴定报道，表明DNA芯片技术可为植物种属鉴定提供快速、高通量的工具。