第一节　萋－尼氏染色显微镜检查

一、检验目的

检测样本中有无抗酸杆菌，为结核病的临床诊断提供参考依据。

二、方法原理

依据分枝杆菌细胞膜含脂质较多，其中主要成分为分枝菌酸，分枝菌酸具有抗酸性，染料将分枝杆菌染色后，分枝杆菌细胞膜能抵抗乙醇等脱色剂作用，使分枝杆菌能保持染料的颜色。分枝杆菌抗酸性是菌体内的分枝菌酸、RNA蛋白及其细菌壁的完整性相结合的综合反应，即抗酸性的强弱除与细菌壁的完整性有关以外，还与其细菌成熟和衰老程度有关。

萋－尼氏染色法，是复红染色液在石炭酸的协同作用下，并对涂片加热促进染色剂同被染细胞的结合，将抗酸杆菌染成紫红色，随后使用酸性酒精脱色，抗酸杆菌能保持紫红色，而其他脱落细胞或标本中的非抗酸杆菌被酸性酒精脱去颜色，后经复染剂亚甲蓝复染为蓝色，光学镜下观察，可在蓝色背景下看到紫红色的杆状抗酸菌。

方法简单、快速、易行且成本低，适于基层广泛开展工作。但是敏感度较低，直接涂片抗酸杆菌显微镜检查的敏感度（5000～10　000菌条／毫升样本）明显低于分枝杆菌培养敏感度（100菌条左右／毫升样本），更低于分子生物学诊断技术敏感度（10菌条左右／毫升样本），阳性结果只能确定是抗酸杆菌感染。

三、检测样本

检测样本包括痰、胸水、腹水、尿液、脑脊液、胃液、脓液（分泌物、穿刺液等）、病理组织或干酪块、粪便和咽喉棉拭子等临床标本和分枝杆菌培养物。

四、仪器设备

生物安全柜、离心机、天平、高压蒸气灭菌器、冰箱、光学显微镜、涡旋振荡器等。

五、试剂耗材

8g碱性复红溶于95%酒精溶液100ml中。

5g石炭酸溶于100ml蒸馏水中。

10ml碱性复红乙醇储存液与90ml　5%石炭酸水溶液混合。

5ml浓盐酸与95ml　95%乙醇混合。

0.3g亚甲蓝溶于50ml　95%乙醇中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml。

以蒸馏水5倍稀释0.3%亚甲蓝储存液即得亚甲蓝复染液。

磨砂载玻片、竹签、2B铅笔、镜油、染色架、玻片盒等。

六、操作步骤

（1）使用一端有磨砂面的无划痕的新玻片，经95%乙醇脱脂，干燥、清洁后备用。

（2）用2B铅笔在磨砂面上注明实验序号及标本序号。

（3）确保玻片的编号与痰盒上的编号相同。

（4）在生物安全柜中，小心打开承载痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢。

（5）仔细观察标本，使用折断的竹签毛茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05ml，于玻片正面轻轻环状均匀涂抹成10mm×20mm的卵圆形痰膜（见图4－1）。

（6）痰膜朝上静置在生物安全柜中自然干燥后（一般约需要30分钟）进行染色。

（7）涂抹完毕后的痰标本，在结果报告前应暂时保留。

注意：打开痰标本容器时，防止产生气溶胶或使标本外溢；为保证检验人员的安全，严禁在涂抹痰标本的同时对载玻片进行加热。

同痰液涂片。

先将组织研磨器研磨后再进行涂片。

送检标本应首先静置2～4小时，取沉淀部分约20～50ml，3000g离心20～30分钟，取沉淀涂片。

参照尿液涂片。

无菌操作收集脑脊液，置冰箱或室温24小时，待薄膜形成后进行涂片；或将脑脊液3000g离心20～30分钟，取沉淀涂片检查。

标本与生理盐水混合后，充分振荡使之成为混悬液；定性滤纸过滤后，滤液经3000g离心20～30分钟；沉淀进行涂片检查。

棉拭子放入无菌试管，加入适量生理盐水浸泡，并强烈振荡，取出棉拭子后，液体在于3000g离心20～30分钟，沉淀进行涂片检查。

流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。

流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。

滴加亚甲蓝复染液，染色30秒。

一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观为亮蓝色，无红色斑块。

1.使用“10×”目镜，双目显微镜读片。

2.取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。

3.首先使用“40×”物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态。

4.移开“40×”物镜，在玻片上滴1～2滴镜油，使用“100×”油镜进行细致观察；但应避免油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。

5.读片时，首先应从左向右观察相邻的视野；当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推（图4－2）。通常20mm的痰膜，使用“100×”油镜，每横行约有100个视野。

6.在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色；其他细菌和细胞呈蓝色。

7.仔细观察完300个视野，一般需要5分钟以上；每个工作日，一位镜检人员的玻片阅读量不应超过25张，且连续阅读10～12张玻片后，应休息20分钟左右。

七、结果判读

结核分枝杆菌基本形态为细长、直或稍弯、两端钝圆、有微荚膜、无芽胞、无动力的杆菌，常呈分枝状生长。菌体宽度在0.2～0.6μm之间，菌体长1～10μm（通常3～5μm）。菌体的一端或两端有较深的异染颗粒，富含多磷酸盐，可能是能量储存和氧化还原反应的场所，有时可呈串珠状。在结核病人痰标本中结核分枝杆菌可单个散在、2个以上呈“人”、“Y”等排列，缠绕呈索状或丛状时为有毒株的典型形态学特征。

结核分枝杆菌在不利条件下导致细胞壁缺陷或部分缺陷（L型细菌）呈现出颗粒型、滤过型和球菌型等不典型形态。在结核分枝杆菌发育的特定阶段，可表现为非抗酸性、非细菌细胞性、革兰染色阳性的颗粒型体。

非结核分枝杆菌形态和抗酸性通常都不典型。

1.萋－尼氏染色抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。

2.萋－尼氏染色抗酸杆菌阳性抗酸杆菌菌数：1～8条／300视野。

3.萋－尼氏染色抗酸杆菌阳性（1＋）：3～9条／100视野，连续观察300个视野。

4.萋－尼氏染色抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条／10视野，连续观察100个视野。

5.萋－尼氏染色抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条／1视野。

6.萋－尼氏染色抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条／1视野。

报告“1＋”时至少观察300个视野，报告“2＋”至少观察100个视野，“3＋”、“4＋”时至少观察50个视野。

不典型抗酸菌（如：颗粒体、丝状体、巨球体等），按实际观察情况描述报告结果。例如：萋－尼氏染色阳性颗粒体（2＋）。

八、注意事项

1.一张载玻片上只能涂抹一份痰标本。

2.每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于抗酸染色涂片检查。

3.涂抹后的痰膜不能太厚或者太薄，透过痰膜看报纸上的5号字时，字迹较模糊为适宜的厚度；看不见5号字或很清晰，则表明该玻片涂抹过厚或过薄。

4.由于香柏油（cedarwood oil）能够溶解复红染料，使萋－尼氏染色褪色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成损害；故禁止使用香柏油，必需使用显微镜专用的镜油（immersion oil for microscopy）。镜油折射系数（RI）应大于1.5，20℃黏度系数应在100～120mPas之间。

1.必须使用新玻片进行涂片检查。

2.每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。

3.所有染液均经过滤。

4.染色时玻片彼此保持一定距离，相互彻底分隔开。

5.严禁使用染色缸染色。

6.染色时勿使玻片上的染液干燥。

7.滴加染色液或镜油时，避免容器滴口直接接触痰膜。

8.严禁物镜镜头直接接触痰膜。

9.作为对照，可采用已知结果为阴性的玻片完成染色镜检过程。

10.完整、准确的标注痰盒、玻片和登记实验登记本。

11.登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。

12.准确记录和报告结果。

1.确认标本是痰而非唾液。

2.确认每份标本至少有3ml。

3.选择干酪痰、血痰和黏液痰涂抹制备玻片。

4.制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。

5.使用高质量染料、严格按照配方配制染液。

6.严格按照操作程序完成染色过程。

7.判断结果为“阴性”前，必须阅读规定要求的视野数。

8.作为对照，可采用已知结果为阳性的玻片，完成染色镜检过程。

9.完整、准确的标注痰盒、玻片和实验登记本。

10.登记前对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。

11.准确记录和报告结果。

1.一些药物可以影响细胞壁中肽聚糖和分枝杆菌酸的合成，可导致其变为L型，呈颗粒状或丝状。

2.临床结核寒性脓肿和痰标本中甚至还可见有非抗酸性革兰染色阳性颗粒，过去称Much颗粒，形态多样，染色多变。

九、质量控制

质量控制包括室内质量控制和室间质量控制。室内质量控制指实验室内部的操作规程、设备和耗材、痰标本收集、染色剂制备、涂片制备和染色、显微镜维护、显微镜镜检、结果登记和报告，以及痰片保存等整个过程的内部检查和监测。

1.制染色液的实验室必须按标准浓度和步骤配制染色液，实验室要有染色液制备配方和配制记录。

2.染色液试剂瓶须标明染色液名称、浓度和制备时间。

3.染色液置于棕色瓶内或者不透明塑料瓶内存放，避光保存。

4.为监测染色液的质量，每次制备一批新的染色液之后，需使用未经染色的已知阳性和阴性涂片进行染色、镜检，并记录结果。

5.购买商品化的抗酸染色液，也必须每批试剂使用未经染色的已知阳性和阴性涂片进行染色、镜检，并记录结果。

1.新载玻片应经95%乙醇脱脂，检查无划痕后方可使用。

2.一张载玻片只能涂抹1份痰标本，且只能一次性使用，严禁清洗后重复使用。

3.推荐使用一端有磨砂面的玻片。

4.2B铅笔在磨砂面上注明实验序号及标本序号，确保玻片的编号与痰盒上的编号相同。

5.大约0.05ml痰标本，在玻片正面右侧2／3的中央处均匀涂抹面积为10mm×20mm的卵圆形痰膜。

6.将已干燥的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的五号字，则表明该玻片涂抹过厚。

1.肉眼观察染色后的痰膜应呈均匀亮蓝色，无红色斑块。

2.染色后的痰膜脱落部分应小于整个涂抹面积的10%。

1.为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁油镜头直接接触涂片上的痰膜。

2.按照结果报告标准仔细观察足够的视野数。

3.每个工作日，一名镜检人员的涂片阅读量不应超过25张。

4.连续阅读10～12张涂片后，应休息20分钟左右。

5.采用自查和互查方式，至少抽查复检当日10%涂片，并填写室内质控登记表（表4－2）。

1.登记前应反复核对检验单、标本盒、涂片上的标注。

2.检查后的每一张涂片结果，应按规定准确记录在“痰涂片检查登记本”上（表4－3）。

3.镜检结果报告应及时发出，以便尽早为临床提供诊断依据。

1.镜检后应及时用擦镜纸轻轻在涂片上揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。

2.涂片脱去镜油后，必须再次核对痰涂片检查登记本与每张涂片实验序号是否一致。

3.涂片上禁止标记镜检的阴、阳性结果。

4.全部涂片按痰涂片检查登记本序号连续排列，存放于玻片盒内。

5.涂片保存与痰涂片检查登记本记录应一致。初诊病人第一张涂片存入涂片盒后需预留出2个空位置，以备第二张、三张涂片检查后放入；随访病人第一张涂片存入涂片盒后需预留出1个空位置，以备第二张涂片检查后放入。

6.对涂片保存量的要求：

（1）根据痰涂片检查登记本记录，按照弃旧存新的原则，保存近期3个月的全部痰涂片待复检。

（2）年涂片量不足500张的实验室，必须保存全年的涂片待复检。

（3）如果近3个月的涂片数超过1000张，可以按照弃旧存新的原则，保存近期1000张的涂片待抽查复检。

（4）装满涂片的玻片盒，需用标签注明涂片实验序号区间和日期区间，以便日后盲法复检或现场评价时抽样。

十、临床意义

萋－尼氏染色抗酸杆菌阳性，说明在检测样本中有抗酸菌存在，但不能确定为结核、非结核或其他分枝杆菌（如诺卡菌属，广泛分布于自然界，亦可引起人和动物的诺卡菌病），需要进一步通过分枝杆菌培养和菌种鉴定才能确定。萋－尼氏染色在结核病防控工作中的意义如下：

结核病的控制是以发现和控制传染源为主，而痰涂片AFB阳性的肺结核患者是社会上最主要的传染源，故痰涂片AFB检查结果对诊断传染性肺结核是一项重要指标。

结核病是由结核分枝杆菌引起的，现行化疗方案的制订也主要以结核分枝杆菌的生物学特性为依据，所以对化疗效果的评价，也将细菌学检查结果作为根据。

由于传染性结核病在流行病学中有着特殊的意义，因此，在反映某一国家或地区结核病疫情的严重程度的指标中，涂阳患病率、涂阳发病率被更多关注。