第四章　肝内胆管树发育生物学

在怀孕前期，大概在第18天，肝脏始基从胚前肠的前侧面长出。第4周初，前肠末端腹侧壁内皮层上皮增生，向外突出一盲管称肝憩室，为肝和胆管树的原基。到第16周，肝脏的组织结构就已经发育形成。然而，肝脏是胎儿的最大组织器官，在妊娠过程中，肝脏不断发育和增殖，至出生后发育完全成熟。肝内胆管树把胆汁从肝脏的原乌氏体引导出来，胆道系统是在肝脏内胚层细胞、肝胚细胞和初级肝脏间（充）质的相互作用之下形成的。

一、肝内胆道解剖学和发育

肝外胆道可以粗略地分成胆总管、（胆）囊管、胆囊和肝总管。肝总管在进入肝脏前，大约在60%至70%肝总管长度处可分叉形成左、右肝管。解剖学的主要变异是右肝管缺失。相反，分布于肝脏右侧的胆管在肝门处与左侧肝胆管融合后产生了前后分支，以左侧肝胆管的三向分支点形式或者是以前、后分支与左侧肝管双向融合变化的形式出现。最后，总肝管及其分支位于肝脏前侧面直至门静脉系统，右后侧的胆管可能缠绕在右门静脉腹侧下方或者是背面上方。胆道系统更小的分支（毛细胆管和终末胆管）只有通过光学显微镜检查才可识别，并且它们不与胆囊周围腺相连。肝内胆道系统的发育见表4-1。

二、终末胆管的数量

Ludwig等证明成人肝内胆道系统有10个分支等级，其中3个为肝脏外部原乌氏体，7个在肝脏内部。胎儿或者新生儿肝脏内肝内分支的级数尚不知晓。因此，在正常成长过程中，肝脏是通过增加小叶结构的复杂性而增加肝内胆管树，还是通过增加已确定的结构单位而长大，目前尚不清楚。儿童尸检以及儿童胆管造影摄片显示在可估值的胆道射线里的胆管支点多达17个。然而，大多数可识别胆管并未显示出16～17个支点，相反却显示呈正态分布，即大多有10种模式。

基于肝脏总容量以及终末胆管所提供的肝脏微结构单元总量要提供2～3mm3的体积，胆道系统分成两个分支。假设认为在新生儿肝脏内的胆道系统将需要17个连续分支等级，而在成人肝脏内却需要18～20个分支等级。超过20个等级后，胆道系统不再变大；低于17个分支等级，肝脏实质就供不应求了。胆道系统分支完全有可能不对称，两种分支之一可能会使衍生分支的数目减少。因此可预期终末分支等级的变化。不管怎样，成人肝脏必须具有400 000～500 000个终末胆管。这一超微结构单元常被称作小叶，据推测在成人肝脏里存在。

三、肝脏始基

在妊娠第18天，当人体内胚胎大约有2.5mm长时，末端前肠的前侧腹面变厚、开始突出，从而形成肝突。接下来几天，内胚层芽向前腹侧朝着横膈生长。横膈是一种使胸腔和腹腔完全分开的间质片（图4-1）。在横膈里，内胚层细胞以分支束形式侵入中胚层。与此同时，窦状血管网从卵黄静脉支流向内生长。新生肝脏就这样形成了，并在接下来的3周内快速生长，很快就占据了腹腔大部分空间。在这一过程中，肝脏原乌氏体与横膈分离，间（充）质的残留物成为横膈膜。这期间卵黄静脉供应发育期肝脏内的窦状血管网状系统，并从卵黄囊延伸至横膈；窦状血管网流入贲门始基内静脉窦的对角。流入胎儿肝脏的静脉流量7周内可精确测定，因为腹部的成对卵黄静脉相互结合形成了门静脉，接着通过被称为门肝或是肝门的部位进入已被大大扩大的肝脏原始基。肝内从门静脉衍生而来的分支静脉系统，以及这些静脉周围的间（充）质现在全都称为肝门束。肝动脉从腹腔干衍生而来，动脉胚芽从种脐开始沿着肝门束长入肝脏始基。

肝外的胆道系统、胆囊和（胆）囊管从肝原基尾部衍生而来，肝原基尾部并不侵入横膈而是连接前肠至发育期的肝脏。除了衍生成为胆囊的支囊外，正好在肝原基进入前肠的入口相邻近的地方，前侧胰腺的始基凸出成膨部。在接下来的几周里，随着前肠绕着它的旋转轴旋转，正在生长的前侧胰腺的始基在背侧面旋转并与分开的背侧胰腺始基相融合。这样，常见胆道位于融合的胰腺内侧，并先于胰腺小叶而在十二指肠乳头胆道口壶腹处进入消化道。

应该注意到肝脏是胎儿体内最大的造血器官。怀孕24周后，肝胚细胞有红细胞生成作用（红细胞生成和粒细胞生成）。25～28周后，造血细胞开始从先前的弥散分布聚集成岛状。到第36周，红细胞生成作用只在肝实质内以分散的岛屿状形式存在。在怀孕32周后，只能看到少量的红细胞在肝门束内生成。在血细胞生成期间，辨别胚胎肝脏里的上皮组织较难，但细胞角蛋白的免疫组化染色有助于观察和鉴别。

四、肝内的胆道系统

最初认为肝内胆道系统起源于肝门的肝外胆道系统，以浸润的形式发育为肝脏。近来更多的证据清楚地表明肝内胆道从肝脏内胚层细胞衍生而来，并重新塑造成人体内管状的网状胆管系统。

在第3～5周，从肝脏支囊延伸至横膈中胚层的内胚层芽叫做肝胚细胞。这些上皮芽形成网索和片。该网索和片把窦状血管网卷入其中，而窦状血管网从基源出发远离卵黄静脉支流，其流出物通过静脉系统流入新生的肝静脉。遍及肝脏原乌氏体的肝胚细胞是双潜能的，可发育为肝细胞或胆管上皮细胞。

肝内胆道系统形成的主要过程发生在肝实质与肝门束间充质接触面之间。大概从第6周开始，紧靠肝门束间充质的肝胚细胞轻微变平，并且形成一个输送胆汁的立方形细胞的连续平层，这个胆汁层称为管状板。与肝实质细胞、肝细胞比较起来，肝胚细胞在管状板形成的时候分化成胆道系统和胆管的两种细胞。在胚胎肝脏里分化不良型肝胚细胞表达细胞角蛋白8、18和19（CK-8、CK-18和CK-19）。紧靠肝门束间充质的肝胚细胞对细胞角蛋白19（CK-19）的免疫反应更为灵敏，而远离管状板的肝胚细胞对细胞角蛋白19（CK-19）失去了免疫反应，只对细胞角蛋白8、18（CK-8和 CK-18）有免疫反应。这样，细胞角蛋白19（CK-19）就成了胎儿肝脏内输送胆汁结构的标志。紧靠肝门束间充质的肝胚细胞和肝细胞保留着分化成肝细胞和胆管细胞的能力。这种双潜在性的能力在“椭圆形”双潜能细胞的存在下，一直持续到成体。该“椭圆形”双潜能细胞与胆管紧紧相邻，并把成熟的胆道系统和肝细胞性实质连接起来。

到20周，种脐附近处于成长期的胆管上皮细胞出现CK-7免疫反应性，此特性可延伸到外周。出生后1个月，CK-7的免疫反应性增加到成人水平。因此，正常成人的肝细胞只表达CK-8和CK-18，而肝内胆道系统表达CK-7和CK-19。CK-20在肝门束种脐区域出现，并从此向外扩展。CK-20活性在出生后有很大的增长。管状板以及成长中的胆道上皮细胞也表达造血干细胞标志，比如c-kit、CD34、CD33。因此，成长期肝脏上皮细胞的免疫染色类型很有特征性。

管状板最初形成于胎儿肝脏内紧靠肝种脐的肝门束周围区域，这一过程以离心的方式从种脐向外持续发生，以至于肝脏的每个区域依次获得一个管状板。在沿途每个点，肝门束间充质细胞插入管状板和其余的肝细胞实质之间并增生。通过这种方式，管状板和它周围的肝细胞实质分开。管状板增生形成输送胆汁的第二层上皮细胞，这样就产生了双层片。随后该双层片获得一个管腔，在门静脉周围形成一圈层状的腔状结构。

从第11～13周开始，重新塑造成成熟的管状胆道系统的管状板从肝门出发并向肝脏的外周生长。起初，这些管状的胆管呈圆形，具有一个椭圆形的内腔。随着时间的推移，管道的横截面变成圆形且更集中地位于肝门束间充质里，剩余外周管状板结构被清除。通过这种有序的选择和清除程序，管状板被改造成长度一定的管状胆管网状系统，这标志着胆管结构开始成熟。

从肝动脉出来的血管丛供应着成熟的胆道系统。动脉血管和胆囊周围的网状组织从种脐开始发育，扩延至外周，其生长方式与肝内胆管相似。胆囊周围的动脉血管丛开始是松懈的毛细血管网，其可随着胆道壁的发育而分化成内外两层。为了维持产后婴儿胆道系统的成熟，出生后肝脏动脉系统继续增生和生长，直到15岁才达到成人水平。成人体内，大约有4条动脉供应着肝内最大的胆道；在终末肝门束水平上，肝脏动脉和终末胆道的比例为1︰1。

五、上皮细胞-间质细胞相互作用

可以认为肝门束间充质对紧靠的肝胚细胞中分化成胆管板的胆道上皮细胞有重要作用。例如，在肝内胆道系统本来就缺乏的情况下，Alagille综合征起因于切迹信号途径里单基因缺损，这种途径是间充质-上皮细胞相互作用的一个关键调节途径。层粘连蛋白——胎儿肝脏内出现最多的细胞外基质蛋白——沿着间（充）质细胞把管状板连接起来。尽管管状板细胞和层粘连蛋白在发育过程中消失，但成人体内分散的与层粘连蛋白结合的小团管状板细胞在肝门束边缘仍旧十分明显。肝脏细胞外基质能够束缚和储存许多生长因子，比如肝细胞生长因子和表皮生长因子。这些生长因子及其它们各自的受体、细胞因子及其受体业已被证明存在于成长期胆管里，这提示它们参与形态的形成和发育。特别是转化生长因子-α（TGF-α）及其受体有较强的免疫反应性，在成长期的肝内胆管就出现，并持续到出生后直至长大成人。因此，胆道上皮与间充质之间的相互作用及其有关分子信号机制对胆管系发育有非常重要的作用。

六、肝内胆道系统的三维结构

通过计算机三维重建技术可以深入了解发育期人体胆道系统。从8个怀孕5.5～16周的人体胚胎获得胚胎组织，将这些组织用CK-19染色且用石蜡包埋。所有样本都显示在肝脏肝门处存在管状板结构。在第5.5周的胎儿里，有一个单层的管状板结构，该管状板结构附属于肝门处一漏斗形状并组成肝外胆道系统与肝内新生胆道系统汇合点。第7周时，肝门处出现具有腔状空隙的双层管状板结构，其立体结构看起来像指状的突出部分，且与肝门里常见的肝管相连续，肝脏肝门邻近处没有观察到管状板结构。到第8.5周，在肝门邻近处已经形成更多的肝脏管状板，就像一个紧挨着门静脉分支、丰富而不透明的胆道结构网。在管状板里，腔状空隙形成一个部分连接、部分分离的网。弯曲的板状网状结构在门静脉处缠绕，其三维重建结构证明了胆管网状系统的网眼直接与肝门处常见的肝管进行腔状相连。此时，肝门周围的板状胆道结构还未塑造成树状分支型的成熟胆道系统。到第11周，管状胆道更加集中在肝门间充质，并在肝门的水平上开始产生。这些管状胆道按顺序与肝脏邻近处的板状胆道结构进行腔状连接。在第12周，肝门完全重新塑造成管状胆管。到第13周，肝内管状胆道系统的第二、三代分支才明显。在接下来几周，管状胆道系统继续以离心的方式成熟。

用计算机进行立体结构的研究中，肝内胆道系统有下列特点：第一，肝外胆道系统没有“稳定的阶段”，正如先前假定的一样。常见胆道的腔隙、新生胆囊和普通肝管保持着开放状态，并一直与消化道管腔相连接。第二，肝脏原乌氏体内胚层上皮细胞与肝外支囊之间的连接，确保了管状板在与原始肝门束内间充质和肝胚细胞之间的接触面形成的时候，它就与肝外胆道系统的上皮细胞相连接了。第三，大约到第6周，管状板开始从肝门向外朝着肝膜离心性地生长，大约到第16周，肝脏所有部位基本上都出现了管状板。有些研究者报道在6～9周里，管状板在肝门处出现，这提示管状板在肝门形成起始时有较大的变异。第四，大约到第11周，管状板开始在肝门束内重新塑造成成熟的管形树状胆管，也同样是离心性生长。第五，管状板形态保持着一致性，而与其在肝脏的部位或者是怀孕的时间无关。在怀孕期间，没有哪个阶段管状板系统具有独特的形态。6周以后，管状板形态学最重要的决定因素是肝脏内的放射状定位。第六，原始管状板结构的腔隙一直与成熟的管状胆道系统以及肝外胆道系统相连接。具体见图4-2。

出生时，管状板并没有完全离心性地改建成管状胆道系统。出生后几个月里，在肝脏外周可以看到管状板结构。肝脏重量由出生时的125g增长至1周岁时的255g，2周岁时为430g，5周岁时为530g。成人肝脏大概重1300～1400g，是新生儿肝脏重量的10倍多。可以推算出产后肝脏将以每年体积扩大2倍的速度生长，差不多超过了管状胆道系统的生长。

七、毛细胆管与终末细胆管

胆道系统与肝实质细胞之间的连接一直是有趣的研究课题。从Elias在1949年用实体幻灯描述正常肝脏的解剖结构来看，胆道系统是经由管状结构、毛细胆管流入肝脏实质直至肝小叶深处。直到1997年才通过光学显微镜证明终末细胆管与肝细胞实质之间的连接是不存在的。Steiner与Carruther等在1961年进行的超微结构研究表明，毛细胆管通路部分是通过肝细胞连接，而部分是通过细胆管上皮细胞连接。这个超微结构已有一个确定的定义——称为终末细胆管，这个定义是Hering 在一个世纪以前提出的。尽管Steiner与Carruthers最初观察指出单侧细胆管在肝实质内延伸，但是在以后40年里，胆管系统与实质之间的连接一般只能在肝门束间充质与实质之间的接触面才看得到。

Crawford 等用光学显微镜对正常成人肝脏进行解剖学研究中，实际上已在组织切片里发现了单独的细胆管结构。用Masson三色染色，每个肝门束就大约可看到一个小叶内小胆管。与此同时，Theise 等用CK-19对正常成人的肝脏部分染色时，发现每个肝门束里大约有10个肝内胆管系统。更为重要的是，用 CK-19染色的邻近组织切片有多达60个相互重叠，这就证明了小叶内胆管系统全都起于终末细胆管、延伸入肝实质，直至终末细胆管与终末肝静脉之间距离的1/3处。正常肝脏内存有小叶间分支，但是分散分布；严重的肝损害会引起小叶内胆道系统的大量增生与分支。在所有病例里，用CK-19进行免疫染色标记的小叶内系统通过肝门束间充质内的细胆管连接到终末胆管。Ekataksin 等证明细胆管起于终末毛细胆管，周围伴有肝门静脉分支（称作中隔静脉）。

毛细胆管和终末细胆管构成了从肝实质引流胆汁的单个单元（图4-3）。正是这种单元含有双潜能祖细胞，双潜能祖细胞是用来重建已被损坏的成人肝脏，并且是胆汁流入的场所以及肝内外成人干细胞的集中位置。

到目前为止，尚未有关终末细胆管在胚胎学上是如何形成的研究。在胎儿管状板发育的整个过程中都观察不到具有CK-19免疫活性的细胞垂直放射穿透进入肝实质。然而，在成人肝实质内具有CK-19免疫活性的细胞链却清晰可见。具有CK-19免疫活性的细胞链是如何渗入肝实质的，目前尚不清楚。

八、肝细胞与胆汁的形成

通过免疫组织化学与电子显微镜研究发现内胚层细胞里最早发育的肝原基最初是未极化的。极化的第一个标志是原始横膈的出现。在超微结构里，毛细胆管最明显的特征是由卷曲的、与肝胚细胞邻近的表面所组成，很显然毛细胆管将要形成微绒毛。紧接着，这些微绒毛在相邻近的肝细胞与成熟的肝细胞之间发育成紧密的复合接连体。一旦复合接连体已经形成，毛细胆管的内腔就开始打开，变成一个充满刚分泌胆汁液的胆管腔。毛细胆管膜的抗原及补体直到出生后才产生。虽然如此，胆汁酸在第5～9周开始合成，胆汁在第12周就开始排泄。管状板-胆管系统的胆道系统开放，保证了早期产生的胆汁液能够顺利到达消化道。

九、胆管周围腺

肝外胆道与肝内主要胆道都有胆管周围腺，这些腺体位于紧挨着肝管内腔的间充质内。为了与遍及消化道的腺体保持一致的生长速度，肝外腺体沿着肝外胆管轴生长。Nakanuma等报道肝内胆管周围腺同样是由管状板上皮组织发育而来。这些腺体最先是在肝门处变成大胆管小外褶才被识别；大胆管不断分支、数目不断增加，形成腺泡结构，直到第40周才被相对浓集的间充质所环绕。出生后，未成熟胆管周围腺泡在数目与组织上继续增加，大约到15岁才完全成熟。从婴儿开始直至长大成人，这些腺泡结构都会分化成胰腺外分泌组织。这种胰腺的分化是一种正常的异位现象而不是组织转化现象。

（陆伦根　茅益民）

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