第二章　胆管细胞免疫生物学

哺乳动物的胆道系统由大小不一的胆管交织形成，胆管细胞即胆道上皮细胞（bile duct epithelia，BDE）参与胆管构成。胆管起始于肝小叶，随后各分支汇集于较大的胆管，最终汇入肝外胆道。既往认为胆管细胞仅为柱状上皮细胞，被动参与肝脏功能的调节。近20年来的研究表明，胆管细胞不仅主动参与肝脏的病理生理过程，且具有重要的调节功能。胆管细胞仅占肝脏细胞的4%～5%，却能分泌每日输出胆汁量的近40%。

新近研究成果表明，胆管细胞积极参与感染性和非感染性肝胆系统疾病的免疫学发病机制。胆管细胞可通过Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）识别病原相关分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs），从而激活复杂的下游反应最终分泌抗菌肽、表达黏附分子及炎症性细胞因子。这些天然免疫和获得性免疫之间复杂的相互作用虽然可以增强胆道的防御功能，但却导致免疫系统对组织的损伤。虽然有许多免疫调节机制可以降低此类损伤但这种适应性机制可能会导致免疫性肝脏疾病的发生。

一、胆道天然免疫

1.Toll样受体

TLRs是一类跨膜受体，在天然免疫中具有重要功能。TLRs可识别微生物中结构保守的PAMPs，产生特异性胞内级联反应，释放炎性细胞因子和趋化因子。在生理或病理状态下，胆汁或者胆管上皮中均可检测出细菌的成分，如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、磷脂酸（lipoteichoic acid，LTA）以及细菌的 DNA 片段。人 H69胆管细胞株可表达所有已知的TLRs，包括髓样分化因子88（myeloid differentiation primary response protein，MyD88）、髓样分化蛋白 2（myeloid differentiation protein-2，MD-2）以及白细胞分化抗原14。当有内源性或外源性的细菌、病毒或寄生虫感染可激活胆管细胞的TLRs，随后胆管细胞可分泌炎性细胞因子及其他抗菌分子参与多种免疫反应，这一过程对维持黏膜内稳态至关重要。LPS可与TLR4相互作用，并与辅助蛋白MD-2及CD14结合，激活衔接蛋白MyD88和白介素1受体相关激酶1（interleukin-1 receptor-associated kinase-1，IRAK-1），最终激活核因子 -κB（nuclear factor-κB，NF-κB），进而诱导胆管细胞释放多种细胞因子，包括IL-1β、IL-8、IL6、单核细胞趋化因子 -1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、肿瘤坏死因子 -α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干扰素γ（interferon protein，IFN-γ）、转化生长因子 -β（transforming growth factor-β，TGF-β）。有趣的是，这一通路不仅在抵御胆管感染中具有重要作用，在原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）等非感染性胆道疾病中，同样具有相当作用。

原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）、自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）及慢性病毒性肝炎时，若存在胆管反应则TLR3表达上调。由于TLR3和TLR7可被RNA病毒激活，而病毒感染是胆道闭锁（biliary atresia，BA）的重要致病因素，因此TLR3和TLR7参与BA的发病。除微生物成分外，一些内源性分子也可激活TLRs，如热休克蛋白、纤维连接蛋白及透明质酸，若上述分子在胆道内出现，则可导致持续性炎症损伤。在PBC、梗阻性黄疸以及PSC患者的胆管细胞中可发现热休克蛋白。无论良性或恶性的胆道疾病，均可检测到纤维连接蛋白水平升高，透明质酸水平在胆管结石患者的胆汁中也有升高。

最近一项研究表明，PSC患者中胆管细胞的抗体可能激活了机体的天然免疫。具体来说，胆管细胞的IgG抗体诱导了TLR4和TLR9的表达，及下游细胞内信号调节激酶-1和NF-κB的磷酸化。在PSC患者的肝脏标本中58% TLR4和TLR9染色阳性，仅有14% PSC患者无IgG抗胆管细胞抗体表达。另一项研究表明，胆管细胞的抗体参与了肝移植后胆管炎和急性排斥反应的发生，此类患者胆管细胞的抗体可诱导胆管细胞表达TLR2和TLR3，并产生炎性细胞因子和趋化因子。

胆管细胞中的TLRs同样可受到一些负向调节。体外培养H69细胞株，使其表达microRNAs家族中的lethal-7（let-7），let-7可通过转录后抑制下调胆管细胞TLR4的表达。隐孢子虫感染的H69中let-7i表达下调，从而继发性引起TLR4表达上调。相反的，HIV-1 tat蛋白可通过翻译抑制下调TLR4蛋白的表达，由此可以解释HIV感染者不易发生胆道隐孢子虫病。

无论在生理或病理状态下，LPS均可存在于胆汁中，但在生理情况下LPS并不触发炎症反应。该现象首先发现于肠道，共生菌群长期存在但并不产生由TLRs激活而导致的组织炎症损伤。“内毒素耐受”的生理学机制是由于细菌PAMPs限制性激活TLRs。Harada等证实，使用TLR4的配体LPS预处理HIBEC细胞株，可使其产生LPS耐受，并通过检测细胞的NF-κB活性和TNF-α mRNA水平以验证。在LPS耐受的细胞中，TLR信号通路的负性调节因子IL-1受体相关激酶-M（IL-1 receptor-associated kinase-M，IRAK-M）mRNA水平升高，由此提示着IRAK-M可诱导内毒素耐受。此外，囊性纤维化跨膜转导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）缺失会导致内毒素耐受消失，而TLR4和NF-κB介导产生的细胞因子增加。这些研究表明，囊性纤维化性胆管炎发病的机制不仅是由于胆汁成分中理化因素的改变，还取决于CFTR缺失而导致的胆管天然免疫系统活性下调。

2.抗菌分子的分泌

（1）免疫球蛋白A：

具有黏膜免疫并协助病原体清除的功能。胆汁中主要的免疫球蛋白为分泌型IgA（secretory IgA，sIgA），而IgM和IgG的含量很低。IgA的分泌过程如下：血清IgA与细胞基底膜的分泌元件相结合，经内吞作用进入细胞，通过交错的管泡途径完成跨细胞转运到达顶端膜。在顶端膜，分泌元件的蛋白发生水解，与此同时，分泌抗体及胞外段。在一些动物实验中（大鼠、小鼠和兔），IgA的转运和分泌发生在肝细胞中。但在人类的肝脏中，由于分泌成元件主要表达在胆管细胞，将IgA分泌入胆汁是小胆管上皮细胞的功能之一。

分泌型IgA在胆道系统中通过整合细菌并防止细菌与黏膜结合，抵抗病原体感染。针对肠道细菌的IgA抗体天然存在于胆汁中，研究表明，将细菌抗原接种到肠道淋巴组织中可诱导胆汁中抗原特异性IgA抗体的分泌。大量动物体内和体外实验证明了胆汁中存在分泌型外周血清抗原与天然诱导或被动产生的IgA抗体复合物。这种机制可能与机体可分泌抗原，并减弱由免疫复合物（免疫复合物性疾病）引发的炎症反应相关。由于IgA的免疫原性要弱于IgG，减弱炎症反应是胆道中sIgA的功能之一。此外，胞吞转运时IgA抗体可与细胞内细菌病原体结合，因此IgA从细胞的基底膜到顶端膜的跨细胞转运可能是细胞抵御病原体的宿主防御机制。

（2）人β-防御素：

防御素是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白，具有抵御细菌、真菌及病毒的活性。防御素与微生物膜结合，形成孔样结构缺陷，使细胞内离子外流导致细胞死亡。α-防御素基本上仅局限于免疫细胞，但β-防御素分布广泛并且可由白细胞和各种上皮细胞分泌。无论是正常人还是患者的胆管细胞都可以分泌β-防御素（human β-defensin，HBD）1，而HBD-2仅在病变的肝脏中表达，尤其是急性胆道感染的患者。表明HBD-1参与胆管的天然性免疫而HBD-2可由局部感染诱导表达。在另一项研究中发现，HBD-1和HBD-3可在H69细胞中表达，HBD-2表达较少，但可被TLR-2和TLR-4活化状态下的隐孢子虫感染诱导上调其表达。由此提示，虽然HBD-1和HBD-3在胆管上皮细胞的非特异性抗微生物免疫中具有一定的作用，但HBD-2的表达是由于TLR的激活，并因此产生了针对特定微生物感染的免疫学反应。

（3）MX蛋白：

属于干扰素诱导产生的三磷酸鸟苷酸动力蛋白超家族。Mx蛋白通过识别病毒的核衣壳并干扰病毒复制来发挥抗病毒活性。

正常肝脏组织中，仅有一小部分Kupffer细胞表达Mx蛋白。在慢性肝病及暴发性肝衰竭中，表达Mx蛋白的Kupffer细胞数目增加，且淋巴细胞、肝细胞和胆管细胞中均发现Mx蛋白表达。Mx蛋白表达上调与IFN-α密切相关。在BA早期患者中，Mx蛋白显著增加，进一步证明了病毒感染在BA中具有重要致病作用。

3.TNF蛋白超家族

通过内毒素耐受防止组织损伤的机制是由于胆道系统中，内毒素耐受可以调节天然免疫对非病原性共生菌PAMPs的反应。由于胆管细胞缺少对TLR3激活的耐受，组织损伤是由于胆管细胞暴露于TLR3配体的双链RNA或合成的激动剂中。在胆管细胞中，通过合成配体激活TLR3，随后NF-κB活化产生IFN-β，及TNF相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）增强细胞凋亡。肝内胆管的胆管细胞TLR3表达增加，激活了NF-κB和干扰素调节因子-3，增加了IFN-γ和Mx蛋白的表达，进而增强了TRAIL诱导凋亡的能力。该研究表明，胆管细胞在天然免疫中的作用不仅可通过产生抗微生物蛋白实现，还可诱导感染细胞凋亡参与天然免疫。Fas配体（Fas ligand，FasL）是TNF家族中的一种跨膜蛋白，可以与Fas受体或CD95结合后诱导凋亡。慢性非化脓性破坏性胆管炎的PBC中可以发现胆管细胞膜和内质网中FasL表达增加，表明在该疾病中Fas介导的途径诱导了细胞凋亡。

4.黏附分子

胆管细胞可表达多种黏附分子，与免疫细胞相互作用参与定位和调节免疫反应。胆管细胞的细胞膜上可表达Ⅰ型人白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）、Ⅱ型HLA、细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-，ICAM-1）和淋巴细胞功能相关性抗原-3（lymphocyte function-associated antigen-3，LFA-3）。胆管细胞表达的其他黏附分子包括：表皮生长因子受体、Fas受体（CD95）、CD40及CD44。重要的是，炎性细胞因子可调控胆管细胞表面黏附分子的表达：IFN-γ、TNF-α以及IL-1都可上调主要组织相容性复合物-Ⅰ（major histocompatibility complex-1，MHC-Ⅰ）、MHC-Ⅱ以及 ICAM-1 的表达，而 TGF-β可下调胆管细胞表达此类分子。有证据表明，在感染性和非感染性胆管疾病中，胆管细胞表面的黏附分子均有所上调。

胆管细胞表面的黏附分子可介导T淋巴细胞和胆管细胞的相互作用从而调节T细胞介导的免疫反应。胆管细胞的ICAM-1和细胞毒T淋巴细胞的LFA-1之间的相互作用导致了胆管细胞损伤。

fractalkine或趋化因子（C-X3-C）配体1（CX3CL1）是CX3C家族中的一种细胞因子，具有趋化因子和黏附分子的功能。可溶状态下，可作为趋化因子，趋化T淋巴细胞和单核细胞；若有细胞与之结合，则可作为黏附分子，使白细胞黏附与表达CX3CR1受体的细胞。无论是否患有肝脏疾病，fractalkine均可表达于胆管细胞。fractalkine在PBC的发病机制中具有重要作用，PBC患者的血清中可溶状态的fractalkine含量增高，这些患者的肝脏组织中CX3CR1阳性的单核细胞和T细胞浸润明显增多。fractalkine在LPS和Th1-细胞因子诱导的胆管损伤中表达上调，导致单核细胞和T细胞被趋化从而黏附于胆管细胞上。TLR3和IFN-α可以上调PBC患者中胆管细胞fractalkine的含量，提示其在PBC的发病中可能具有一定作用。

5.细胞表面抗原识别分子

抗原提呈是细胞介导的免疫反应中最关键的起始步骤。表达MHCⅡ是抗原提呈细胞（antigen-presenting cells，APCs）的标志。胆管细胞表面有MHCⅡ的表达，因此其为潜在的APCs。体外使用炎性因子IL-1、TNF-α以及IFN-γ刺激胆管细胞，MHCⅡ表达增强。此外，在移植排斥反应、PBC和PSC患者肝脏里损伤的胆管中可检测到MHCⅡ表达增加。

细胞介导的免疫反应除了需要MHC-Ⅱ/TCR相互作用之外还需要协同刺激分子的参与。B7-1（CD80）和B7-2（CD86）是（病理）生理过程中非常重要的协同刺激分子。胆管细胞是否表达B7-1和B7-2存在争议。Leon等研究表明，这些协同刺激分子无论在正常情况下或使用IFN-γ和TNF-α刺激均不表达于胆管细胞。另一方面，有研究证明，早期PBC（Ⅰ期或Ⅱ期）患者的胆管细胞中有B7表达。在胆汁淤积小鼠新鲜分离的胆管细胞中可检测到B7-1（CD80），B7-2（CD86）、MHCⅠ以及MHCⅡ的表达。由于目前仍存在争议，因此仍需深入的研究以判断胆管细胞是否具有APCs的功能。

胆管细胞可能具有抑制T细胞活化的功能。程序性死亡配体1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）和程序性死亡配体 2（programmed cell death ligand 2，PD-L2）均为属于 B7 家族的跨膜蛋白，可与PD-1的受体（CD279）结合并传递抑制信号，抑制T细胞增殖。正常情况下，H69细胞和原代HIBECs均可表达PD-L1（B7-H1）的mRNA但并不表达PD-L1的蛋白，这是由于miRNAs抑制了其翻译；然而使用IFN-γ刺激胆管细胞可阻断该下调蛋白的表达，从而反应性引起PD-L1表达上调。由此表明，INF-γ可上调H69细胞和原代HIBEC中PD-L1和PD-L2的表达。在PD-L1和PD-L2的功能受到阻断抗体抑制时，使用抗原刺激胆管细胞可以在一定程度上激活T细胞。总而言之，这些数据表明胆管细胞可以直接调控T细胞的功能，因此胆管细胞和T细胞的相互作用可能是胆管疾病非常重要的起始因素或是后续作用机制。

6.炎性细胞因子

趋化和跨内皮迁移是炎症发生的基本步骤，随后具有免疫活性的细胞归巢从而启动炎症反应。胆管细胞可分泌大量细胞因子和趋化因子，招募循环中的免疫细胞。原代人肝内胆管细胞可表达和分泌IL-8和MCP-1，IL-8可以诱导中性粒细胞趋化，MCP-1可趋化单核细胞并诱导其分化。在慢性病毒性肝炎和肝硬化晚期，再生胆管的胆管细胞MCP-1表达升高，并伴随巨噬细胞和单核细胞的浸润。炎症因子又可调控胆管细胞对IL-8和MCP-1的分泌，IL-1和TNF-α可促进IL-8和MCP-1的分泌，然而IFN-γ促进MCP-1分泌但抑制IL-8分泌。在胆汁淤积、肝外胆管阻塞以及急性重型肝炎等肝脏疾病中，小胆管的增生与胆管细胞中IL-8的表达密切相关。

胆管细胞也可通过调控炎性因子和趋化因子的分泌，以募集免疫细胞的方式调节免疫反应。多项研究证实，原代培养的HIBECs细胞中，IL-1可诱导IL-6的分泌，PBC患者肝内胆管的胆管细胞可以分泌IL-6和TNF-α。由于胆管细胞可表达IL-6和TNF-α的受体，这些细胞因子可在胆管细胞处于自分泌状态时调控其功能。保持胆管细胞的数目就是自分泌IL-6的重要作用之一；TNF-α可通过上调MHCⅡ的表达、促进炎性因子IL-8和MCP-1的分泌以及诱导细胞毒T淋巴细胞调控胆管细胞的免疫功能。类似于在肝细胞中的作用，TNF-α可促进胆管细胞的凋亡，导致胆管损伤。此外，胆管细胞可分泌TGF-β，TGF-β的下游效应包括刺激胆管细胞分泌内皮素-1，促进肌纤维母细胞分化为门静脉周围的成纤维细胞（portal fibroblasts，PF）及抑制原代人胆管细胞的有丝分裂。

胆管细胞积极参与了自身诱导的免疫性胆管损伤，可分泌介质招募免疫活性的细胞进入胆道，并通过表达细胞黏附分子增强细胞免疫。因此，天然免疫和获得性免疫反应可能均参与慢性胆管炎、胆管损伤以及肝纤维化的发病过程。

二、胆管细胞在肝纤维化中的免疫学作用

肝脏肌成纤维细胞形成不可逆瘢痕可导致肝硬化，是慢性肝病的致死性并发症。肝脏的肌成纤维细胞主要有两个来源：PF和肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）。PF与胆管纤维化密切相关，在胆管树中与胆管细胞相邻，而HSC主要存在与窦状隙，在肝脏和胆管纤维化中均具有非常重要的作用。胆管细胞可分泌炎性细胞因子和趋化因子，因此在肝纤维化中同样具有关键性作用。

胆汁性肝硬化中胆管细胞可调节性分泌IL-6。胆管细胞可表达基底P2Y核苷酸受体，与细胞内Ca2+和cAMP升高相关，Ca2+和cAMP作用于IL-6启动子的Ca2+/cAMP反应原件。ATP存在的情况下，刺激该受体可以诱导胆管细胞分泌IL-6。随后，IL-6与PF的IL-6受体结合，引起PF中NTPD2的显著下调。E-NTPD2是胆管细胞P2Y受体功能的首要调节因素，该过程建立的调节机制进一步促进了胆管细胞分泌IL-6。在胆汁性肝硬化中，IL-6从两方面维持胆管细胞的数量。首先，IL-6以自分泌的形式促进胆管细胞增殖。其次，由于细胞外ATP可以促进胆管细胞增殖，IL-6敏感性下调PF的NTPD2水平，反应性引起胆管细胞增殖。值得注意的是，IL-6维持胆管功能是保持体内稳态的关键。小鼠由于缺乏IL-6信号通路，在胆汁性硬化中的死亡率显著增高。

新近研究提示胆管细胞分泌的MCP-1在胆汁性硬化中具有非常重要的作用。在胆管增生的小儿肝脏病中（包括BA）MCP-1表达上调，上调程度与疾病严重程度相关。此外，在恒河猴轮状病毒感染的BA模型中，胆管细胞对MCP-1的分泌量增加。胆管细胞分泌MCP-1促进纤维化的发生，尤其是MCP-1可以诱导肌成纤维细胞的分化、凋亡以及PF对Ⅰ型胶原的分泌。由于MCP-1可诱导HSC归巢，因此胆管细胞分泌的MCP-1可促进瘢痕组织形成。

胆管细胞可通过胆管反应，包括胆管的损伤和修复、炎症浸润及诱导肌纤维母细胞分化为PF加重肝脏损伤。因此，针对上述环节的治疗策略都可预防和治疗胆汁性肝硬化。

三、维持胆管上皮的完整性

三叶因子肽家族（trefoil factor family，TFF）是由胃肠道黏液细胞分泌的抗蛋白水解酶小蛋白。该肽家族中的成员包括：TFF-1、TFF-2以及TFF-3，均具有六个高度保守的半胱氨酸残基，称为“三叶阈”。TFF肽可增加肠液的黏度，从而防止肠道上皮受损，并通过增强肠道上皮细胞的伸展和迁移能力促进伤口愈合。TFF-1和TFF-3在正常肝脏的大胆管中表达，若大胆管受损其表达增加。但TTF-2并不表达于正常的肝脏组织中，而在肝内小胆管受损后表达增高。PBC患者胆管损伤后，TTF-3在小胆管中的表达不同于大胆管，由于缺少了TTF-3的黏膜保护作用，病理情况下小胆管更容易受到损伤，由此可解释PBC患者小胆管更容易受到损伤的机制。胆管细胞TFF-3的表达受IL-6/gp130/STAT3通路调节。

富含脯氨酸的小蛋白（small proline-rich proteins，SPRR）是1号染色体编码的表皮分化复合物（epidermal differentiating complex，EDC）的一部分。具体来说，SPRRs具有类似交联蛋白的功能，在其他由EDC编码的蛋白之间形成交联桥，从而形成抵御外部环境的有效屏障。在正常的小鼠肝脏中，SPRR2A在胆总管结扎后可表达于胆管细胞，IL-6/gp130/STAT3通路可以上调胆管细胞SPRR2的表达。胆管细胞SPRR2的功能包括保护黏膜屏障、防止氧化损伤以及促进伤口愈合。

四、结论

胆管细胞并不是被动构成胆道的上皮细胞，它参与特异性免疫并可释放多种物质调节免疫功能。胆管细胞免疫生物学是病理生理领域中的新兴学科，并与胆道系统疾病的发生机制有密切的联系。虽然目前仍缺乏胆管细胞免疫生物学的整体观点，但该领域在近年来已取得了明显进步。由于胆管细胞的免疫学功能导致了特异性疾病之间存在差异，因此进一步的研究应聚焦于胆管细胞免疫学功能造成的疾病特异性改变。

（李郑红　陆伦根）

参考文献

［1］ Syal G，Fausther M，Dranoff JA.Advances in cholangiocyte immunobiology.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012，303：G1077-G1086.

［2］ Chen XM，O’Hara SP，LaRusso NF.The immunobiology of cholangiocytes.Immunol Cell Biol，2008，86：497-505.

［3］ Chuang YH，Lan RY，Gershwin ME.The immunopathology of human biliary cell epithelium.SeminImmunopathol，2009，31：323-331.

［4］ Harada K，Nakanuma Y.Biliary innate immunity in the pathogenesis of biliary diseases.Inflamm Allergy Drug Targets，2010，9：83-90.

［5］ O’Hara SP，Tabibian JH，Splinter PL，et al. The dynamic biliary epithelia：molecules，pathways，and disease.J Hepatol，2013，58：575-582.

［6］ Harada K，Nakanuma Y.Innate immunity in the pathogenesis of cholangiopathy：a recent update.Inflamm Allergy Drug Targets，2012，11：478-483.

［7］ Kawata K，Kobayashi Y，Gershwin ME，et al.The immunophysiology and apoptosis of biliary epithelial cells：primary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangitis.Clin Rev Allergy Immunol，2012，43：230-241.