3.房颤的转基因治疗

心房颤动（房颤）是临床上最常见的心律失常，是导致脑卒中和心衰的重要原因，严重影响患者的生活质量。随着年龄的增长，房颤的发病率逐渐增高，40岁以下房颤患者发病率仅为0.5%，大于85岁患者房颤发病率升高至6%～12%，房颤相关住院率由1966年的0.35%提高至2006年的1%，大大增加了医疗保健支出。据估计在未来的20～30年中房颤患者人数将会是现在的2～3倍，因此积极预防及治疗房颤极为重要。

目前房颤治疗方法主要为：抗心律失常药物或导管消融术治疗房颤以维持窦性心律；药物或房室结消融并起搏器植入术以控制心室率。药物治疗房颤1年复发率约50%，抗心律失常药物具有低亲和力和低特异性，并可致全身副作用和诱发致命性室性心律失常的可能。导管射频消融术治疗房颤发展至今，对持续性房颤一次治疗的成功率仅为40%～70%。一项最新研究表明，房颤1次射频消融术后1年复发率约为66%，6年复发率可达77%；多次房颤射频消融术6年复发率达61%，射频消融费用高昂，且射频消融术后可能出现严重，甚至致死性并发症；一项多中心研究表明，有4.5%的患者出现心房-食管瘘、脑卒中等严重并发症。对于房颤难以控制的心室率，房室结射频消融术阻断房室结后行永久起搏治疗，也可能因起搏器综合征、囊袋感染等并发症严重影响患者的生活质量，甚至增加死亡风险，并会给患者带来巨大的经济负担。总之，无论是药物治疗或是非药物治疗，均未能达到满意效果。所以寻求房颤新的治疗策略也势在必行。

心房重构（结构重构和电重构）是房颤发生与维持的重要机制。心房重构造成心房有效不应期缩短及局部心房传导速度减慢，从而形成电折返环，维持房颤持续发生。随着基因学及基因转染技术的不断发展，从基因水平上阻断房颤发生与维持的重构机制，从而达到治愈房颤的目的可成为现实。另外，在控制心室率方面，对于长期慢性持续性房颤患者，通过基因治疗的方法改变房室结内的电活动，延缓房室结传导速度，从而控制房颤时的心室率。本文主要针对近年来房颤基因治疗，包括载体选择、转染方法及治疗效果进行综述。

一　基因转染载体的选择

基因载体选择的基本前提是：靶基因能有效转染心肌并在心肌内高效并持续性表达，同时还应具备系统毒性低、致免疫性弱和易于制造等特点。

1.质粒DNA

质粒DNA有致免疫性低、低系统毒性、稳定性高、易于制造和高器官选择性等优点，但其因质粒种类少、基因转染方式费用高及有效表达率低等限制了其应用。

2.腺病毒

腺病毒（Ad）是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其具有以下优点：①人类是Ad的自然宿主，故其系统毒性小，致病性低，不易被补体所灭活，可直接在体内应用；②其复制不依赖于宿主细胞的分裂，既可以感染分裂期细胞，又可以感染非分裂期细胞；③由于其感染细胞时DNA不整合到宿主染色体上，不存在激活致癌基因或插入突变等危险；④腺病毒可制造出高滴度病毒溶液提高转染效率；⑤腺病毒可携带外援基因量大（可达28～34kb）；⑥基因表达至高峰时间短（7天），能短期观察目的基因表达效果。其主要不足点：基因表达持续时间短（仅3～4周），重复给予时机体可能产生免疫应答，影响基因表达和治疗效果。

3.腺相关病毒

腺相关病毒（AAV）是单链DNA病毒，是一种缺陷型病毒，只有与腺病毒、单纯疱疹病毒等共感染时才能进行有效复制。其优点：①AAV无致病性，并且在受染体上不会引发免疫反应；②宿主范围广，既可以感染分裂期细胞，又可以感染非分裂期细胞；③AAV载体可将外源基因整合至宿主基因，并且能长期稳定高效表达；④易于分离纯化。AAV也有一些缺陷，如外源基因容量小及基因表达起效慢等。

4.慢病毒

慢病毒（lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷Ⅰ型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，是逆转录病毒的一种亚种。具有逆转录病毒的基本结构和特性，转入的外源基因可与宿主细胞基因组完全整合，建立细胞系长期持续表达外源基因，对细胞感染率高，不产生病毒相关免疫蛋白等优点；区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。其主要不利因素为插入基因在与宿主细胞整合过程中发生突变或产生野生型病毒，影响目的基因表达或损害患者健康。

二　基因转染方法

心房大小、形态及心房肌厚度限制了直接注射法的应用，因心房缺乏特异性脉管系统限制了冠状动脉灌注法的应用。心包内注入病毒转染仅能存在于心外膜层并且基因在整个心脏心外膜表达而无区域特异性。近十余年来，随着转染方法的不断改善，房颤基因治疗有了进一步发展。目前常用的基因转染方法有：①心房直接涂染法；②心房肌注射+心肌电穿孔复合法；③房室结动脉直接灌注法。

1.心房直接涂染法

心房直接涂染法是目前应用最广泛的心房基因转染方法。2005年，Kikuchi等将含有腺病毒的溶液涂抹于猪心房表面，每次30秒，每侧心房涂染2次，总时间为60秒，其后将心房暴露10分钟以便病毒充分吸收。21天后测量相关指标。该实验中腺病毒载体溶液为20%泊洛沙姆（poloxamer），一种在4℃时能充分转化为液体，而在体温时能充分转化为凝胶状状态的物质，可使含病毒溶液充分、有效接触心房肌细胞；糜蛋白酶能增加心房目的基因转染的透壁性，同时还证明透壁性心房基因转染所需最佳糜蛋白酶浓度为0.5%；该法对心肌细胞仅有轻微炎症反应；此外，心室、肺、肝、脾、肾、骨骼肌及性腺中均未见腺病毒相关基因表达，同时实验中未发生自发性心律失常。此后Amit和Garashi等均采用类似方法将靶基因成功转染至心房肌细胞并具有透壁性，且实验中均无自发性心律失常。综上所述，心房直接涂染法不但可形成透壁性心房基因转染并有效表达靶基因，同时还具有安全性、有效性及特异性等优点。

2.心房肌注射+心肌电穿孔复合法

电穿孔是通过短暂的高强度电脉冲波作用于细胞或组织，这种高强度的电刺激造成细胞膜的不稳定，从而形成细胞膜表面纳米大小的微孔，瞬时提高细胞膜的通透性，在这种高通透性状态下，细胞膜允许DNA、酶、抗体等大分子物质进入细胞内。1998年，Harrison等人首次证明应用电穿孔能将质粒DNA携带的靶基因成功转染至鸡胚胎心脏中。2011年，Bikou等首先对猪心房行电穿孔处理，随后将含表达Cx43基因的腺病毒（Ad-Cx43）溶液直接注射至心房肌中，Western-blot法及免疫组织化学法均证明在心房肌细胞中过表达Cx43蛋白。此后Aistrup、Soucek及Trappe等均采用类似方法将含靶基因的腺病毒成功转染至心房并有效表达。综上所述，心房肌注射+心肌电穿孔复合法具有有效性及特异性。

3.房室结动脉直接灌注法

相较于心房缺乏特异性脉管系统，房室结（AVN）存在房室结动脉。2000年，Donahue等选取右冠优势型并仅有1支房室结动脉，将导管放置于AV结动脉开口，将包含5µg的血管内皮生长因子165（VEGF165，可增加微血管通透性）及含200µg硝酸甘油的10ml生理盐水在3分钟内缓慢注射，将包含7.5×109pfu腺病毒载体（含靶基因）及含20µg硝酸甘油的1ml生理盐水缓慢注射，注射时间超过30秒，2ml生理盐水缓慢注射，注射时间超过30秒，7天后测量相关指标。该实验结果显示基因转染区域主要在房室结区及其相邻的少量室间隔区域，房室结区基因转染率为（45±6）%；房室结心肌细胞仅有轻微炎症反应；此外肝、肾、卵巢中仅有少量靶基因表达（表达率＜1%），肺及骨骼肌中未见腺病毒相关基因表达。此后，Bauer及Lugenbiel等人均采用类似方法将靶基因成功转染至房室结细胞。综上所述，房室结动脉直接灌注法不但可特异性将靶基因转染于房室结心肌细胞并有效表达靶基因，同时还具有安全性、有效性的优点。

三　治疗策略

1.改善心房重构

心房重构是房颤发生与维持的重要机制。心房重构造成心房有效不应期缩短及局部心房传导速度减慢，从而形成电折返环维持房颤持续发生，故房颤治疗的关键在于阻断其发生与维持的重构机制。

（1）直接改善离子通道：

临床研究表明，房颤患者心房动作电位时程（APD）较窦性心律者的APD明显缩短。房颤患者心房有效不应期（AERP）缩短，离散度增加而频率变异性丧失。抗心律失常的药物可通过延长APD或AERP，使房颤转复为窦性心律。因此，通过心房转基因治疗延长APD/AERP，从而防治房颤的发生及发展。

最早Kikuchi等运用基因涂染法将含有HERG-G628S基因的腺病毒载体（Ad-HERG-G628S）成功转染至正常猪的心房并有效过表达HERG-G628S基因。该实验证明，HERG-G628S基因过表达能有效阻断HERG通道，抑制IKr电流，延长APD90及AERP，且实验过程中无自发的心律失常，同时不影响心房的收缩功能。

此后Amit及Kikuchi等在猪急性房颤模型上运用基因涂染法，将含有过表达KCNH2-G628S基因的腺病毒载体（Ad-KCNH2-G628S）成功转染至心房，过表达大肠埃希菌β半乳糖苷酶基因腺病毒载体（Ad-β-gal）为对照组。过表达KCNH2-G628S基因可抑制心房中IKr的α亚基，进而抑制IKr电流。Ad-KCNH2-G628S组动物转变为持续性房颤的时间较Ad-β-gal组明显延迟。该实验中APD90延长程度与Ad-KCNH2-G628S基因表达水平相关，随着基因表达程度降低，APD90延长程度减弱，对房颤发展的阻碍作用减弱（图1-3-1）。该实验证明，延长AERP可阻断折返环的形成，从而中断房颤的维持机制。实验过程中心室电活动无改变，无室性心律失常发生。

近期Soucek等在猪急性房颤模型上运用心房直接注法+心外膜电穿孔复合法将含有过表达CERG-G627S基因的腺病毒载体（Ad-CERG-G627S）成功转染至心房，过表达绿色荧光蛋白基因腺病毒载体（Ad-GFP）为对照组。过表达CERG-G627S基因可抑制ERG/IKr电流。Ad-CERG-G627S组发展为持续性房颤所需时间延长，甚至阻碍房颤的形成。起搏14天后，Ad-CERG-G627S组的AERP及MAP显著延长。该实验还证明Ad-CERG-G627S组较Ad-GFP组左室射血分数明显改善。该实验证明延长AERP及MAP阻断折返环形成，从而延迟或阻碍持续性房颤的发展，并且改善心房电重构可延缓房颤的形成，还可改善心功能，同时不存在药物治疗中的致心律失常作用。

（2）抗交感神经：

在心房中，迷走神经释放乙酰胆碱（ACh）刺激2型毒蕈碱胆碱能受体（M2Rs），激活三聚体的Gαi/oβγ蛋白，将Gαi/o亚基从Gβγ分离。Gβγ激活IKACh导致心房APD显著缩短，为折返环的形成创造条件。

Aistrup等证明，通过阻断这一路径，可延长有效不应期（ERP），从而中断房颤维持机制。在犬急性房颤模型上，运用直接注射法+电穿孔复合法成功将含有靶基因的DNA成功转染至犬的左房后壁，分组为：过表达Gαi2蛋白的Gαi2ctp治疗组、过表达Gαi2蛋白和（或）Gαo蛋白的Gαi2ctp+Gαoctp复合治疗组、过表达GαR蛋白的GαRctp阴性对照组。Western-blot法证明Gαx蛋白在左房后壁中显著表达。免疫组化法进一步证明左房后壁的心肌细胞及神经丛中均有Gαx蛋白表达。相较于GαRctp组的房颤的诱导率及诱导房颤的持续时间，Gαi2ctp组明显减少，Gαi2ctp+Gαoctp组是三组中最低的。刺激迷走神经兴奋能诱导心房ERP缩短，相较于GαRctp组，Gαi2ctp组能明显减弱这一作用，而Gαi2ctp+Gαoctp组几乎完全阻断这一作用。卡巴胆碱（CCh）是一种非选择性M受体阻断剂，可缩短心房ERP；Gαi2ctp组能减弱低浓度CCh（3µmol 及10µmol）对心房ERP的作用，对高浓度CCh（30µmol）无明显作用；无论是低剂量还是高剂量的CCh均不能引起Gαi2ctp+Gαoctp组的ERP缩短。表明过表达Gαi2ctp减弱迷走神经兴奋诱导房颤，Gαi2ctp+Gαoctp联合表达可进一步减弱迷走神经兴奋诱导房颤这一作用。

（3）细胞连接蛋白：

连接蛋白43（Cx43）和连接蛋白40（Cx40）是构成心房细胞缝隙连接的主要亚基，其表达水平和定位分布异常在实验性房颤动物模型和人类房颤患者中早已明确。实验证明，细胞连接蛋白Cx40的缺失会减慢心房传导速度，增加房颤的稳定性。无论是在房颤动物模型还是房颤患者均发现Cx43的表达减少与电传导速度减慢相关。

2011年，Bikou等在猪急性房颤模型上运用直接注射+电穿孔复合法，将过表达Cx43基因的腺病毒成功转染至心房（房颤-Ad-Cx43组），房颤-Ad-GFP组为对照组，14天后测量各组相关数据。Western-blot法及细胞免疫组织化学证明：房颤-Ad-Cx43组Cx43蛋白表达水平较房颤-Ad-GFP组明显升高。房颤-Ad-Cx43组转变为持续性房颤所需时间较房颤-Ad-GFP组明显延长，且房颤-Ad-Cx43组心率较房颤-Ad-GFP组慢（图1-3-2）。房颤-Ad-Cx43组右房传导速度（CV）较房颤-Ad-GFP组明显增快；而在左房中两组CV差异无显著性，这可能与Cx40在两侧心房中的分布不同及Cx40与Cx43交叉作用有关。Ad-GFP组因房颤及其所致的快速心室率导致LVEF明显降低；Ad-Cx43组LEVF于心房快速起搏前后无明显差异。该实验证明，改善细胞连接蛋白重构可以有效预防房颤形成并能改善心功能。

2012年，Igarashi等在猪急性房颤模型上运用基因涂染法将含有靶基因的腺病毒成功转染至心房，具体分组为：房颤-Ad-Cx40组、房颤-Ad-Cx43组、房颤-空白对照组、SR-Ad-Cx40组、SR-Ad-Cx43组、SR-空白对照组。Western-blot法证明：房颤-Ad-Cx40组的Cx40表达水平和房颤-Ad-Cx43组的Cx43表达水平较房颤-空白对照组明显增加。房颤-Ad-Cx40组和房颤-Ad-Cx43组转变成为持续性房颤的时间较房颤-空白对照组明显延长（图1-3-3），且房颤-Ad-Cx40组和房颤-Ad-Cx43组的横向及纵向传导速度较对房颤-空白对照组明显增加，但两者组间及与SR的各组间均无明显差异。表明正常条件下心房Cx蛋白过表达不能影响心房传导速度，暗示缝隙连接蛋白并非影响心房传导速度最关键的因素，但Cx蛋白过表达的确可以在房颤状态下改善CV并延迟阵发性房颤向持续性房颤转变所需时间。

（4）延缓细胞凋亡：

心房纤维化是房颤发生与维持的重要机制。房颤会增加心肌细胞的凋亡，凋亡的心肌细胞逐渐被纤维化组织所取代，从而造成心房传导速度减慢，心房传导速度的改变为房颤的维持创造条件，这是一个恶性循环的过程。

无论在房颤患者，还是在犬类房颤模型中均发现半胱天冬酶-3（caspase-3）表达增加。Trappe等在猪急性房颤模型上用直接直射+电穿孔复合法，将含有表达编码半胱天冬酶-3沉默核糖核酸的腺病毒（Ad-siRNA-Cas3）成功转染至心房；Ad-GFP为对照组。Western-blot法及细胞免疫组织化学法证明，右心耳中半胱天冬酶-3的表达明显降低；TUNEL法证实右心耳细胞凋亡较对照组明显减少，证明siRNA-Cas3基因在心房中成功表达。Ad-siRNACas3组相较于Ad-GFP组，房颤的发展所需时间延长（图1-3-4）。Ad-GFP对照组中纵向传导速度较横向传导速度明显减慢。Ad-GFP组右房组织纵向传导速度相较于Ad-siRNA-Cas3组明显减少，右房横向传导速度两组间无明显差异。Ad-siRNA-Cas3组纵向传导速度与横向传导速度无明显差异。表明caspase-3的降低可减少细胞凋亡，从而延缓心房传导速度的减慢程度，延迟或阻碍持续性房颤的发展。该法在改善心房传导功能的同时并不存在药物治疗中延长AERP的副作用。

2.调整房室结传导功能

在房室结区，β肾上腺素受体与刺激性G蛋白（Gs）耦联，刺激β受体激活Gs释放Gs亚基，继而刺激腺苷酸环化酶，这一进程诱导一系列细胞内反应，造成AV细胞传导速度加快及有效不应期缩短。Gs的相关效应可被抑制G蛋白（Gi）抵消。Gi可与M2Rs结合，激活Gi释放Gi亚基结合并抑制腺苷酸环化酶。在房室结区过表达Gi或抑制Gs表达可减慢AVN的传导功能。

最早Lugenbiel等运用房室结动脉灌注法将含编码Gi2基因的腺病毒（Ad-Gi）转染至房室结；Ad-β-gal为对照组。第7天测量各组数据，X凝胶染色及Western-blot法均证明靶基因在AVN有效表达，Ad-Gi组的Gi2的含量是Ad-β-gal组的5倍。Ad-Gi组基因转染7天后较基因转染前的PR间期、AH间期和房室结有效不应期（AVNERP）均明显延长。导管诱发房颤并测量心室率，Ad-Gi组基因转染7天后较基因转染前心室率下降20%。在肾上腺素作用下，Ad-Gi组基因转染7天后较转染前心室率下降16%；Ad-β-gal组转染前后心室率无改变。过表达Gi可抑制腺苷酸环化酶，延长PR间期、AH间期和AVNERP，降低房性心动过速时的心室率。

此后Bauer等在猪慢性房颤模型上运用房室结动脉灌注法将含靶基因的腺病毒载体转染至房室结，分组为：过表达cGi基因的Ad-cGi组，过表达wGi基因的Ad-wGi组，Ad-β-gal为对照组。对动物模型的症状及心功能情况进行评估，Ad-β-gal组动物超声心动图提示心脏各腔室增大，LEVF明显降低，心衰症状加重。Ad-cGi组动物超声心动图提示左房和右室直径无明显变化，左室直径较前缩小，LEVF近乎正常，无明显心衰症状。Ad-wiG组动物超声心动图提示左房直径增大，其余各腔室直径无明显变化，LEVF轻度改善心衰症状介于上述两组之间。在麻醉状态下再次测量各组的心室率变化情况，Ad-cGi组心室率减少16%±3%；Ad-wiG组心室率减少12%±5%；Ad-β-gal组心室率减少5%±5%；而在非麻醉状态下，Ad-cGi组心室率减少15%～25%，Ad-wiG组及Ad-β-gal组无明显改变（图1-3-5），考虑这可能与房颤及慢性心衰造成高肾上腺素状态有关。

近年Lugenbiel等在猪房颤/CHF模型，运用房室结动脉灌注法将含靶基因的腺病毒载体转染至房室结，分组为Ad-siRNAGαs组、Ad-β-gal组和Ad-GFP组。证明Ad-GFP组靶基因在房室结区有效表达，且心室率下降程度与Ad-siRNA-Gαs基因表达水平相关，随着基因表达程度降低，对Gαs作用减弱，心室率下降程度减弱（图1-3-6）。20天时Ad-siRNA-Gαs相较于Ad-β-gal组，AH间期延长37毫秒，HV间期延长28毫秒。超声心动图证明Ad-siRNA-Gαs组较对照组可明显减轻房颤对LVEF的损害程度。麻醉状态下异丙肾上腺素对AdsiRNA-Gαs组心率无明显改变，而Ad-βgal组在药物作用下心室率明显加快。运用Western-blot法对L型钙通道的单位（α1C、α1D及α2）、钠-钙交换通道蛋白（NCX）、兰尼碱受体、信号转导通路相关蛋白（β1受体、PKA、磷酸化PKA、腺苷酸环化酶Ⅰ及腺苷酸环化酶Ⅵ）进行检测，仅观察到α2在Ad-siRNA-Gαs组中较对照组中减少30.2%，其余标志物两组间无显著差异。这些证实Gαs蛋白表达减少为房颤心室率减少的最本质因素。通过AdsiRNA-Gαs抑制房室结中Gαs蛋白，从而阻断交感兴奋，抑制腺苷酸环化酶，延长不应期时间，减慢AV传导，最终减慢心室率。

四　基因治疗存在的问题

1.选用的载体绝大部分为腺病毒载体，虽腺病毒达峰值时间短，但其靶基因表达效率在7天后逐渐减弱，21天时几乎无靶基因表达，不能长期持续性治疗房颤。

2.部分将质粒DNA转染于心房，但其所需成本高，靶基因有效表达时间也较短，不能长期治疗房颤。

3.目前房颤基因治疗措施仅能延缓房颤发展或通过控制心室率改善症状，均不能完全阻断房颤形成。

4.直接作用心房基因转染需行开胸手术，转染过程复杂，手术过程中造成心包及心外膜炎症反应；作用于AVN需有高选择性的房室结动脉，同时AVN基因转染效率低，这些限制其应用。

今后房颤基因治疗研究中，有必要开发可长期表达靶基因的载体及操作简便微创的靶向治疗技术，同时将改善心房电重构及结构重构联合应用可能更加有效的预防及治疗房颤。

（张阳　刘增长）

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