第一篇　心律失常的基础研究

1.心房的基因表达与变异

与心室肌细胞不同，心房肌细胞除了收缩射血功能以外，亦可以分泌神经激素信号分子，并可作为外源性神经激素信号的靶点。随着人类基因组计划的完成，基因芯片、全基因组关联研究以及测序技术的进步极大地推动了对心房基因表达的研究进程，同时研究的范围也得到了很大拓展，不仅涉及生理及病理状态下基因表达水平的改变，而且包含基因变异与心律失常的关联研究。对人类心房所特有的基因表达谱及基因变异的研究，可以帮助更好地理解心房的工作机制，并为心律失常提供潜在的治疗靶点。本文将对近年来本领域的研究进展进行总结介绍。

一　正常人类心房表达谱

多年来，人们致力于心房所特有的基因表达模式的研究，以期进一步了解心房在生理及病理状态下如何行使其功能。出于伦理等方面的需要，在进行正常人类心房组织的基因表达水平研究时，心房组织多来源于心衰晚期需要心脏移植的患者，而非真正意义上处于生理状态下的心房组织。虽然心衰患者主要累及心室，但是心房在心衰过程中由于血液流变学的变化，可能也会发生功能以及结构水平的重塑，这些均会影响基因的表达水平，不过鉴于目前的研究都是集中在基因表达水平的差异比较上，这样的组织来源对结果的影响不会太大。

早期的表达谱研究主要集中于探索心房与心室表达基因的差异。早在2002年，美国德克萨斯州大学的学者们就比较了小鼠心房和心室基因表达的差异，并报道了心房组织中高表达的一些基因［肌球蛋白轻链1A、肌球蛋白轻链2A、肌脂蛋白（SLN）、结缔组织生长因子、凝溶胶蛋白等］。随后，Peter等运用Affymetrix（HG-U133A）高密度寡核苷酸探针所制成的芯片对6个心脏移植患者（心衰患者，NYHA心功能Ⅳ级）的左房及左室的两万多个转录本进行了差异表达检测，在成功检测到7115个转录本后，研究者发现心房组织中有40个基因的表达水平明显高于心室组织，这些基因包括SLN、FK506结合蛋白11、心肌肌球蛋白重链6以及钾通道亚家族［TWIK-1（KCNK1）、TASK-1（KCNK3）、Kv1.5（KCNA5）、SK2（KCNN2）］。2005年，Andreas等人则采用Affymetrix（U133A+B）芯片对17位患者的右心耳与若干例遗体捐赠者的左室组织进行了全基因组检测，此次研究不仅在芯片技术水平上有所进步，即探针数量达到了四万多个，在此基础上还对所检测到的基因进行了功能注释。共成功检测到11 740个探针，其中心房组织中特异性高表达的探针数量达到了3300个。对这些差异基因进行功能分类以后发现，心房组织中线粒体转录本的表达水平明显低于心室组织；在心房组织中高表达的基因数量较多并参与多种细胞过程，比如细胞间联系、对外刺激反应、胆固醇及蛋白糖苷类代谢，其分子功能涉及受体活性和受体信号蛋白活性。该研究不仅验证了以前报道过的心房与心室的差异基因NPPA和NPPB、ADM、TBX5、KCNA5、AGTR1，MYL3和MYL4，KCNK1和KCNK3、KCNJ3、SLN、PLN等，而且首次发现ErbB受体——ERBB2/3/4在心房中处于高表达状态。这些结果也说明心房的重要功能之一就是参与细胞间联系及信号传导，这些基因的高表达使心房可以及时对血液流变学的变化以及神经内分泌刺激作出反应。

近两年，随着对心房表达谱认识的不断深入以及表观遗传学研究的热潮，基因表达的研究内容也得到了进一步的丰富，除mRNA表达水平的差异以外，人们逐渐开始研究心房miRNA的表达水平。2012年，Hsu等对左右心耳的miRNA和mRNA的表达水平同时进行了系统研究，发现miR-143为左右房中表达水平最高的miRNAs。左右房的miRNAs表达确实存在差异，共发现32个miRNAs在左右房中的表达水平存在差异（表1-1-1）。其中18个miRNAs在左房的表达水平高于右房；另外14个miRNAs则在右房中高表达。此外，对mRNA表达水平的研究发现左右房共有746个差异基因，其中305个基因在左房中高表达，441个基因在右房中高表达。将这些差异基因根据P值排序后，排名在前20的基因见表1-1-2，这些基因中PITX2在左房高表达，经过对19个心房组织的PITX2表达水平进行RT-PCR验证后，验证结果亦显示PITX2在左房中高表达。与之相对应的是受PITX2抑制的BMP10在右房中高表达，这些都说明这次检测结果的可靠性。此次的研究还发现两个心肌特异的转录本MYL2和HCN4分别在左房和右房中高表达。研究者在分析了差异mRNA模体的基础上，发现165个心房基因的3'UTR区有miR-133a的结合位点，miR-133a与之结合以后会导致其表达水平降低，对其表达起到负调控作用。研究结果表明，这些基因在右房的表达水平均高于左房，与此相对应的是miR-133a在左房的表达水平高于右房，这也解释了其目标mRNA在左房低表达的机制。这一研究富有创新性，将mRNA与miRNA的表达水平同时进行研究，在分析差异基因的同时，又解释了部分基因差异表达的机制，这一方法在以后的研究中也被诸多借鉴。

2014年初，Heart Rhythm又发表了一篇研究心房基因表达谱的文章，该研究将53个左房与52个右房的表达谱进行比较后发现，109个转录本所对应的106个基因在左右房组织中的表达水平存在差异。左房中表达量最高的基因为AKR1B1，右房中表达量最高的基因为SMAD6。研究者将这一结果与2012年的研究结果进行对比后发现，2012年所发现的前20个基因中有9个在这次研究结果中再次得到证实（表1-1-3），如先前报道的差异基因HAMP、BMP10、PITX2、MYL2、HCN4等在这次的研究中再次得到证实。同时两次研究结果所筛选的差异基因也存在一定的差异，如先前报道的差异基因SALL1、KRT7在这次的研究中并未得到进一步证实，其原因可能在于样本量的差异，2012年的研究其组织来源较少，仅4个心脏组织，而这次的研究样本多达53个。将差异基因进行富集分析后发现排名前三的生物过程分别为对生物过程的负向调控、解剖结构发育以及单个器官的发育过程。

二　病理状态下心房表达谱的改变

（一）房颤时心房表达谱的改变

房颤是临床上常见的持续性心律失常，临床上多数的抗心律失常药物均为离子通道阻滞剂，但是大规模的临床试验并未发现这些药物可以降低患者的死亡率，另一方面，其致心律失常的作用也极大地限制了它们在非结构性心脏疾病患者中的应用。通过研究房颤患者基因表达水平的改变，可以帮助了解房颤发生的分子机制，为临床发现新的药物靶点奠定基础。房颤的病理生理机制涉及心脏电重构、收缩功能及结构重塑，这些进行性的改变与心脏的基因表达密切相关。有鉴于此，很多研究均试图运用候选基因的办法来研究编码离子通道以及钙稳态相关蛋白，以解释电重塑的过程。

近年来，有几项研究均从整体角度阐述了房颤时重塑的分子学基础。Kim等对26位非持续性房颤患者及26位非房颤对照进行基因表达水平的研究，共检测分析了1152个基因，发现房颤患者有30个基因表达水平上调，25个基因表达水平下调。对基因功能分析后发现氧化应激相关的基因与房颤的发生密切相关，即与氧自由基产生有关的5个基因（加单氧酶1、单胺氧化酶B、泛素特异性蛋白酶8、酪氨酸相关蛋白1及酪氨酸3-加单氧酶）表达水平升高，而抗氧化的两个基因（谷胱甘肽过氧化物酶和血红素氧化酶2）表达水平降低。由此可见，氧自由基产生与抗氧化能力的平衡失调导致的细胞损伤与房颤的发生密切相关。但是由于对照组的病理状态未知，所以这项研究的结果有待进一步验证。后期的研究表明房颤的发生确实与氧化还原平衡失调有关，有报道称NADPH氧化酶活性升高与术后房颤的发生密切相关。2005年，Peter等通过比较8位窦性心律与5位慢性房颤患者（房颤时间长于6个月）右房的基因表达水平，发现TWIK-1表达水平降低与慢性房颤的发生密切相关。

随后，Ohki-Kaneda等对7个慢性房颤患者和10个配对对照的12 000个基因进行检测分析后发现了众多差异表达基因，并最终确定了11个差异基因与房颤相关，这些基因有SGCE、HLF、RPS9、RPS11等。Barth随后对10位慢性房颤患者和20个未配对对照进行了表达谱分析，此次共分析了45 000个基因，通过对比后发现房颤患者中有1434个基因与对照组相比有显著性差异。这些研究给了我们很多的提示，但是由于前期所检测的差异基因较少，后期病例与对照未做好配对，所以研究本身有一定的局限性。随后，Guillaume将房颤病例与窦性心律对照（心脏瓣膜疾病）做了严格的配对后，采用50mer的长片段寡聚核苷酸探针对4000个与心功能相关的基因进行检测分析后，发现169个基因与房颤有关，对这些基因进行功能注释后发现，这些差异基因与基因-蛋白表达、肌节及细胞骨架的功能、免疫应答、肌肉收缩、纤维化、凝血等功能有关。这次研究还发现了多个新的房颤相关基因：GATA结合蛋白4（GATA4）、活化T细胞的核因子（NFATC1）、a2巨球蛋白（A2M）、内皮蛋白C受体（EPCR）等。

（二）房颤相关的基因变异

近年来的研究表明，房颤的发生还与基因变异有关。近十年来，随着测序技术的进步以及全基因组关联研究的开展，房颤相关的单核苷酸多态性位点也在不断被发现。目前已发现的与房颤相关的SNPs位点如下：

ACE基因的3个位点M235T、G-6A和G-217A；在染色体4q25 PITX2附近的2个多态性位点；ZFHX3基因上的rs2106261位点；SCN5A基因上的H558R位点；KCNN3基因上的rs13376333位点；Cx40基因的-44（G→A）位点等。此外，钾通道基因、GJA5以及KCNQ1基因的某些突变位点均与房颤的发生有关。

（三）表达数量性状座位探讨基因表达谱与单核苷酸多态性之间的联系

2014年初，Lin等在Heart Rhythm上发表了一篇文章，这篇文章首次将心房的mRNA表达水平与SNPs位点同时进行研究，并利用表达数量性状座位（eQTL）对转录组与基因变异之间的关系进行研究。研究者将已知的9个与房颤相关的染色体位点附近（500kb）的SNPs位点与心房转录本进行关联分析后，发现位于SYNPO2L基因3'UTR区的rs3740293位点与MYOZ1关系最为密切。这一结果也通过定量PCR得到了进一步的验证。这一研究将转录组学的研究与基因变异联系起来，为全方面了解心房基因的表达水平及基因变异的关系提供了新的思路。

总之，随着技术的进步，人们对心房基因表达和变异的认识也在不断的深入。从组织来源来看，最初的组织主要来源于心衰晚期的患者；近几年对心耳以及遗体捐赠者的心房组织的表达谱分析帮助我们更好地了解了生理状态下的心房基因表达情况。从研究思路上看，最初研究者只是集中于分析心房和心室组织的差异表达基因；近年来，左右房差异表达的mRNA、心房的miRNA表达水平等都逐渐被大家所了解。从实验设计上看，从最初只能检测几千个转录本的芯片到现在商业化的高通量表达谱芯片，研究对象的范围无形中被扩大了很多。尤其值得注意的是，现在的研究越来越关注mRNA表达水平差异的机制，新的技术和思路均试图从某个角度去解释这种差异产生的分子学基础，以帮助我们更好地理解心房在生理及病理状态下的工作机制。相信在不久的将来这一领域的研究成果会为心律失常的治疗提供新的靶点。

（刘周英　浦介麟）

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