11.窦房结细胞的钙钟和膜钟

心脏起搏功能的最新观点认为，窦房结细胞是钙钟和膜钟（膜电压钟）相互作用的系统。钙钟和膜钟联合调节窦房结的自律性。由于完整的窦房结是由不同成分组成的结构，其中包括多种不同细胞类型且相互作用，而且窦房结的不同区域这两种钟的功能也不同。钙钟和膜钟对窦房结的起搏功能十分重要。

一　窦房结细胞的钙钟和膜钟的概念

肌质网自发性Ca2+释放是窦性心律的产生机制之一。当肌质网中Ca2+充满时，产生自发性Ca2+释放；反之，当肌质网中Ca2+排空时，自发性Ca2+释放的概率减少。这种肌质网自发性Ca2+释放的节律变化称为钙钟。窦房结细胞的舒张晚期细胞内Ca2+浓度升高产生动作电位上升肢，这是钙钟起搏的象征。由于肌质网中Ca2+浓度的其中部分释放是由膜电压控制的，所以钙钟和膜钟的激活是相互依赖的。膜钟是指细胞膜上离子通道的开放和关闭取决于膜电位，因而这种细胞膜上离子通道的周期性激活和失活过程称为膜电压钟或膜钟（图1-11-1）。

二　窦房结细胞的钙钟和膜钟的产生机制

正常窦房结节律是由细胞内Ca2+周期（钙钟）触发膜钟而影响动作电位的节律。窦房结细胞的钙钟表现为自发性、准时性、节律性肌质网局部Ca2+释放，其发生在下一次动作电位触发之前。这些节律性Ca2+释放是由兰尼碱受体（ryanodine receptors，RyRs）产生的，可激活Na+/Ca2+交换器（Na+/Ca2+ exchanger，NCX）的内向电流，1个Ca2+的排出伴有3个Na+进入细胞，产生舒张期去极化。这些节律性Ca2+释放激活NCX内向电流，促使膜钟产生节律性动作电位。RyRs位于肌质网膜上，是起搏细胞的主要Ca2+池。超极化激活起搏电流（hyperpolarization-activated pacemaker current，If）、L型钙通道、延迟整流K+电流和T型钙通道参与膜钟形成，其中If起主要作用。If是Na+-K+混合内向电流，由超极化激活，并由自主神经调节。If主要参与4相舒张期复极早期，在动作电位结束后被激活，电压阈值-100/-110mV～-40/-50mV。当舒张期去极化达到阈值时，L型钙通道激活并产生动作电位。而肌质网局部Ca2+释放参与4相舒张期复极晚期，是通过激活NCX产生内向电流而形成。

RyRs紧紧挤压成簇并与L型钙通道连接起来形成Ca2+释放单元（Ca2+ release units，CRUs）。当肌质网外细胞内的Ca2+增加时，RyR就被激活开放而引起Ca2+诱导Ca2+释放（Ca2+-induced Ca2+ release，CICR）。单个Ca2+释放单元可以产生小量瞬时局部Ca2+增加，称为钙火花，半径约1.5µm。而半径约4～12µm的局部Ca2+释放需要相邻的Ca2+释放单元通过漫火传播触发数个钙火花参与。钙火花的特征如半径大小和幅度并不是不变的，而是受β肾上腺素受体兴奋每个Ca2+释放单元的Ca2+电流变化所调节。当多个局部Ca2+释放同时发生时可触发NCX产生内向电流。钙钟观点提示自律性机制与迟后除极机制相同，只有当肌质网中Ca2+超载时才会发生，表明正常情况下窦房结存在Ca2+超载状态。窦房结细胞的高基础水平蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）活性可能维持Ca2+超载状态。

三　窦房结细胞的钙钟和膜钟的临床意义

窦房结细胞的自发放电的两个可能机制是钙钟和膜钟。窦房结细胞的变时功能状态受局部Ca2+释放特征共同变化的调控，包括Ca2+释放量、节律和时间，这对窦房结细胞的起搏功能十分重要。钙钟功能障碍相关的疾病发生于基因组RyR2外显子-3缺失的患者。这种基因突变的患者可发生儿茶酚胺敏感性多形性室速、窦房结和房室结功能障碍、房颤及心房静止。膜钟下调可能与快速性房性心律失常有关，可能是快-慢综合征（tachy-brady syndrome）的机制。是否钙钟功能障碍也参与快-慢综合征的机制还不清楚。除此，心衰时，细胞内Ca2+处理异常，使钙钟功能障碍，对交感神经的激动不能正常反应。除了窦房结钙钟功能异常外，由于If下调也使膜钟受损，窦房结对β肾上腺素刺激加快心率的作用减弱。心衰时窦房结细胞的If下调而右房明显上调，这是心衰时发生窦房结功能障碍和房性心律失常的机制。此外，钙钟功能障碍时心房颤动可发生病态窦房结综合征，而儿茶酚胺敏感性室速可引起窦性心动过缓。另外，胚胎干细胞衍化的未成熟心肌细胞的自发电活动也依赖于细胞内Ca2+信号机制，从个体发育观点来看，这种“原始”属性可以看做是成熟心脏窦房结保留的发育步骤。

四　生物起搏器与膜钟、钙钟

随着现代科技的发展，生物起搏器逐渐进入人们的视野，也由于电子起搏器的种种缺点，目前认为理想的起搏器应该是生物起搏器。心脏生物起搏主要包括基因治疗和细胞治疗。从心脏生理功能和人体适应性的角度，生物起搏器也成为将来的发展趋势。下面主要阐述如何通过细胞治疗和基因治疗的方法实现钙钟及膜钟的功能以构建生物起搏器。

在过去15年间，在分子水平关于心脏离子通道和干细胞生物学研究的飞速发展，对于构建生物起搏器提供了支持，这样可替代电子起搏器的广泛应用。目前的生物起搏器主要有以基因为基础的和以干细胞为基础的方式。钙钟和膜钟的相互耦合、相互作用，共同构成了起搏细胞自动除极化的基础。其中又涉及超极化激活的环核苷酸门控通道（hyperpolarizationactivated cyclic nucleotide-gated channel，HCN）、内向整流Kir2.1钾通道及生物起搏器系统中的缝隙连接的作用。

对于生物起搏器，If和IK1电流对于细胞膜的稳定性和舒张期去极化的作用十分重要。HCN和Kir2.x钾通道的不同程度的表达和If和IK1的独特的属性产生窦房结和心室肌细胞的动作电位和静息电位。

对于构建生物起搏器，调控HCN和Kir2.1的基因表达是一个以基因为基础的方法。另一个可选择的尝试，就是以细胞为基础的方法，即应用已经表达想要的对于起搏有用的离子通道的细胞或者可以分化为想要的细胞如干细胞。生物起搏可以通过基因工程、细胞治疗或者两者相结合。组成心脏起搏动作电位的关键分子基础——离子通道和钙激活蛋白，对于生物起搏的基因治疗为首选方法。多能干细胞可作为携带这种基因优秀的载体，以确保植入的细胞转换成一个类似起搏细胞的细胞。

（一）基因为基础的方法实现钙钟及膜钟的功能以构建生物起搏器

1.β肾上腺素受体的过度表达

利用基因工程技术转染β肾上腺素受体的互补DNA，下调内向整流电流，使自律性心肌细胞高表达起搏电流，形成生物起搏。β肾上腺素受体（βAR）通过G蛋白耦联的信号传递系统调节心肌细胞的变力性（收缩性）和变时性（收缩速率），刺激β肾上腺素受体可以通过G蛋白激活cAMP。腺苷酸环化酶可以刺激ATP转化为cAMP，它可以提高If活动性。If电流是膜钟假说的重要电流。因此，β肾上腺素受体的过度表达是间接的通过膜钟的作用来实现生物起搏作用的。

2.IK1的抑制

成人心室肌细胞具有潜在的起搏活性，但是通常受到内向整流钾电流（IK1）抑制，该电流具有强大的稳定静息电位于负值的作用，因而抑制激动。通过IK1通道的抑制，它可以导致静息膜电位的增加、动作电位持续时间的延长和4期去极化电位的感应。心脏通过4相自动去极化产生重复规律的自发性电活动，外源性刺激可诱发出动作电位时间延长的电位，达到与起搏细胞最大舒张电位相似，对β肾上腺素刺激产生与起搏细胞一致的反应——增加起搏频率。

3.If的强化

“膜钟学说”认为超极化时会激活起搏细胞特有的超极化激活内向电流（funny current，If），使膜电位负值减少至阈电位水平，其周期性的变化便形成“膜钟”。转染超极化激活的环核苷酸门控通道2（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 2，HCN2）基因形成超极化激活的阳离子流，引起心肌细胞自动去极化，具有起搏功能。因此，If的强化可以增加膜钟的作用以达到生物起搏的作用。

4.生物起搏器的通道工程的创建

Kv1.4是一个不在心室肌表达的电压依赖的通道。通过定点诱变的方法转变为一个去极化激活的非选择性阳离子通道。这个研究表明，在人类心脏的心室舒张期去极化过程中诱导出心室起搏活动的，不必须是HCN通道，也可以是时间依赖的内向电流。

（二）细胞为基础的方法实现钙钟及膜钟的功能以构建生物起搏器

1.天然的心肌细胞移植构建生物起搏器

同种、异种心肌细胞移植能够在宿主心肌组织中成活，与宿主心肌细胞发生电、机械整合；含窦房结细胞的心房肌细胞移植后，在宿主心室发挥起搏功能并主导心室节律。心肌细胞移植可构建心脏生物起搏器。

2.干细胞衍生的心肌细胞（干细胞移植构建心脏生物起搏器）

（1）胚胎干细胞移植建立生物起搏器：

成人胚胎干细胞来源的心肌生肌细胞能表达一定的激素水平，对儿茶酚胺反应，并受一定的生理功能调节，更符合人体生理；成人胚胎干细胞移植构建心脏生物起搏器能产生稳定搏动心律，是较理想的移植细胞。

（2）间充质干细胞移植建立生物起搏器：

多项研究得出结论，间充质干细胞能够构建技术平台得到心脏起搏点，相关实验发现几乎所有的间充质干细胞均可记录到外向电流，包括钙激活钾电流及氯非铵敏感性外向电流，有的细胞还可记录到L型钙电流，有传导电流的能力。

对于细胞治疗相关的生物起搏器，它们的主要思想就是利用可以通过钙钟、膜钟自发产生细胞膜去极化，产生动作电位，从而产生节律性心脏跳动的过程。

（刘元生　张帆　王志鹏）

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