第23章 柠檬酸循环
23.1 复习笔记
一、丙酮酸进入柠檬酸循环的准备阶段—形成乙酰-CoA
1．丙酮酸转变为乙酰CoA
（1）总反应式
（2）丙酮酸脱氢酶
丙酮酸脱氢酶是一个复合酶，其组成如表23-1所示。
表23-1 丙酮酸脱羧酶复合体的组成
2．催化丙酮酸转变为乙酰-CoA的反应步骤
（1）丙酮酸脱羧反应
①该反应由丙酮酸脱氢酶组分E1催化。该酶以TPP为辅基。它催化的反应式为
②丙酮酸脱氢酶组分的催化反应步骤
a．发生在TPP辅基的催化反应，形成羟乙基-TPP-E1；
b．羟乙基氧化形成乙酰基。
（2）形成乙酰-CoA
由二氢硫辛酰转乙酰基酶催化，将其结合的乙酰基转移到CoA-SH分子上，形成游离的乙酰-CoA分子，从而使二氢硫辛酰转乙酰基酶成为还原型的二氢硫辛酰转乙酰基酶。这是一个酯基转移反应。
（3）还原型二氢硫辛酰转乙酰基酶氧化，形成氧化型的（二氢）硫辛酰转乙酰基酶
①这一步反应是使氧化型硫辛酰胺再生的反应。
②氧化型的NAD＋起着氧化剂的作用，催化此反应的酶称为二氢硫辛酸脱氢，简称E3，又称二氢硫辛酰胺脱氢酶，该酶的辅基是FAD。二氢硫辛酸脱氢酶使二氢硫辛酰胺再氧化，从而使其完成了它的全部反应过程。
（4）还原型的E3再氧化
还原型E3二硫键的再氧化先由该酶结合着的辅基FAD接受-SH基的氢原子，形成FADH2，接着又将氢原子转移给NAD＋，于是恢复其氧化型。
3．丙酮酸脱氢酶复合体催化反应的简单图解
丙酮酸脱氢酶复合体中的三种酶，它的辅助因子有辅酶A、NAD＋、TPP、硫辛酰胺和FAD，丙酮酸脱羧形成乙酰-CoA的复杂过程可用简单的图解如图23-1所示。
图23-1 丙酮酸脱氢酶复合体催化反应图解
4．砷化物对硫辛酰胺的毒害作用
（1）砷化物对机体的毒害不仅限于对糖酵解的抑制作用。
（2）砷化物的毒害作用机制是与丙酮酸脱氢酶复合体中的E2辅基硫辛酰胺的巯基发生共价结合，使还原型硫辛酰胺形成失去催化能力的砷化物。这类砷化物抑制丙酮酸脱氢酶复合体的机制同样表现在对α-酮戊二酸脱氢酶的抑制作用。
5．丙酮酸脱氢酶复合体的调控
（1）产物控制
①由产物NADH和乙酰-CoA控制。
NADH与乙酰-CoA的抑制作用是和酶的作用底物即NAD＋和CoA竞争酶的活性部位，是竞争性抑制。乙酰-CoA抑制E2，NADH抑制E3。
②[NADH]/[NAD＋]和[乙酰-CoA]/[CoA]的比值
当[NADH]/[NAD＋]和[乙酰-CoA]/[CoA]的比值高时，E2处于与乙酰基结合的形式而不能接受在E1酶上与TPP结合着的羟乙基基团，使E1酶上的TPP停留在与羟乙基结合的状态，从而抑制了丙酮酸脱羧作用的进行。
（2）磷酸化和去磷酸化的调控
在处于丙酮酸脱氢酶复合体核心位置的E2分子上结合着激酶和磷酸酶。
①激酶使丙酮酸脱氢酶组分磷酸化，磷酸酶则是脱去丙酮酸脱氢酶的磷酸基团从而使丙酮酸脱氢酶复合体活化。
②Ca2＋通过激活磷酸酶的作用，也使丙酮酸脱氢酶活化。
二、柠檬酸循环概貌
1．柠檬酸循环是在细胞的线粒体中进行的。
2．柠檬酸循环的起始步骤可看作是由4个碳原子的化合物与循环外的两个碳原子的化合物形成6个碳原子的柠檬酸，柠檬酸经过异构、氧化、脱羧、氧化脱羧和三次转化最后又形成4个碳原子的草酰乙酸。即：
完成一次循环
图23-2 柠檬酸循环概貌示意图
三、柠檬酸循环的反应机制
1．草酰乙酸与乙酰-CoA缩合形成柠檬酸
（1）总反应式
这是柠檬酸循环的起始步骤，含有两个碳原子的化合物以乙酰-CoA形式进入柠檬酸循环。以硫酯形式进入的乙酸含有足够的能量，使反应能顺利进行。
（2）柠檬酸合酶
①柠檬酸合酶催化上述反应，它是柠檬酸循环中的限速酶；
②柠檬酸合酶属于调控酶。活性受ATP、NADH、琥珀酰-CoA、酯酰-CoA等的抑制；
③柠檬酸合酶是由两个亚基构成的二聚体，其中含有一个草酰乙酸结合位点。由草酰乙酸与酶结合后而诱导出的构象变化，产生了乙酰-CoA的结合部位并且杜绝了溶剂对草酰乙酸的干扰。这是一个典型的由于底物与酶结合而诱导产生的诱导楔合模型。
（3）柠檬酸合酶催化反应的机制
柠檬酸合酶催化的反应属于醛醇-克莱森酯缩合反应，它的反应可划分为3步，如图23-3所示。
图23-3 柠檬酸合酶催化的缩合反应
（4）柠檬酸合酶的抑制剂
①氟乙酰-CoA
a．由氟乙酸形成的氟乙酰-CoA可被柠檬酸合酶催化与草酰乙酸缩合生成氟柠檬酸。它取代柠檬酸结合到顺-乌头酸酶的活性部位上，从而抑制柠檬酸循环的下一步反应。
b．由氟乙酰-CoA形成氟柠檬酸的反应称为致死性合成反应。这一特性可用于制造杀虫剂或灭鼠药。
②丙酮基-CoA
丙酮基-CoA是乙酰-CoA的类似物，可对乙酰-CoA的反应产生抑制效应，因可代替乙酰-CoA与柠檬酸合酶结合。
2．柠檬酸异构化形成异柠檬酸
（1）反应式
（2）异柠檬酸酶
①异柠檬酸的酶又称乌头酸酶，能催化柠檬酸和异柠檬酸互变的双向反应，没有旋光性但有手性。
②乌头酸酶含有由共价键结合的4个Fe2＋。这4个Fe2＋和4个无机硫化物、4个半胱氨酸的硫原子一起结合成团，称为Fe-S聚簇。Fe-S聚簇与柠檬酸结合，并参与底物的脱水和再水合作用。
3．异柠檬酸氧化形成α-酮戊二酸
（1）反应式
异柠檬酸氧化脱羧是一个氧化-还原步骤，也是柠檬酸循环中两次氧化脱羧反应中的第一个反应。氧化的中间产物是草酰琥珀酸。
（2）异柠檬酸脱氢酶
异柠檬酸脱氢酶在高等动植物以及大多数微生物中有两种。
①以NAD＋为辅酶，只存在于线粒体中，需要有Mg2＋或Mn2＋激活；
②以NADP＋为辅酶。既存在于线粒体中也存在于细胞溶胶中。
（3）β-裂解
由β-羟酸氧化为β-酮酸，从而引起脱羧反应，也就是促进了相邻C-C键的断裂，称为β-裂解。这种β-裂解是生物化学中最常见的一种C-C键的断裂方式。
（4）异柠檬酸脱氢的生物学意义
通过这一步反应，使生物体解决了具有两个碳原子的乙酰基氧化和降解的问题。
（5）异柠檬酸脱氢酶的调节
①异柠檬酸脱氢酶是一个变构调节酶。它的活性受ADP变构激活。ADP可增强酶与底物的亲和力；
②该酶与异柠檬酸、Mg2＋、NAD＋、ADP的结合有相互协同作用；
③NADH、ATP对异柠檬酸脱氢酶起变构抑制作用。在能荷低的情况下NAD＋的含量升高，这有利于柠檬酸脱氢酶，对其他需要以NAD＋为辅助因子的酶促反应也有推动作用。
（6）异柠檬酸酶的磷酸化和脱磷酸化
①细菌中的异柠檬酸脱氢酶受磷酸化的抑制。在酶活性部位的丝氨酸被磷酸化，则会抑制酶与异柠檬酸底物的结合。
②使异柠檬酸脱氢酶磷酸化的酶称为异柠檬酸脱氢酶激酶，使磷酸化了的异柠檬酸脱氢酶脱去磷酸的酶称为异柠檬酸脱氢酶磷酸酶。这两种不同作用的酶处于同一条肽链上。
4．α-酮戊二酸氧化脱羧形成琥珀酰-CoA
（1）反应式
这是柠檬酸循环中的第二次脱羧。该反应需要NAD＋和CoA作为辅助因子。
（2）α-酮戊二酸氧化释放出的能量的作用
①驱使NAD＋还原；
②促使反应向氧化方向进行并大量放能；
③相当的能量以琥珀酰CoA的高能硫酯键形式保存起来。
（3）α-酮戊二酸脱氢酶
①α-酮戊二酸脱氢酶是一个多酶复合体，由α-酮戊二酸脱氢酶（E1）、二氢硫辛酰转琥珀酰酶（E2）、二氢硫辛酰脱氢酶（E3）组成；
②反应需要TPP、硫辛酸、CoA、FAD、NAD＋、Mg2＋6种辅助因子。
（4）α-酮戊二酸脱氢酶的调节
①α-酮戊二酸脱氢酶是一个变构调节酶，受其产物琥珀酰-CoA和NADH的抑制，也受高能荷的抑制；
②α-酮戊二酸脱氢酶不受磷酸化、去磷酸化共价修饰的调节。
5．琥珀酰-CoA转化成琥珀酸
（1）反应式
这是柠檬酸循环中唯一直接产生一个高能磷酸键的步骤。
（2）琥珀酰-CoA合成酶
琥珀酰-CoA合成酶又称琥珀酰硫激酶，催化的反应产生一个高能磷酸键；在哺乳动物形成一分子GTP，在植物和微生物直接形成ATP。
（3）GTP在生物合成中的作用
①GTP在蛋白质的生物合成中是磷酰基供体，参与信号的传递过程；
②GTP在核苷二磷酸激酶的催化下将磷酰基转给ADP生成ATP。
6．琥珀酸脱氢形成延胡索酸
（1）反应式
（2）琥珀酸脱氢酶
①琥珀酸脱氢酶是唯一嵌入到线粒体内膜的酶，而其他的酶大多存在于线粒体的基质；
②以FAD作为其脱下电子的受体，琥珀酸脱氢酶与FAD是以共价键互相连接，因此是酶和辅基的关系。，而且这个辅基是一种修饰形式；
③琥珀酸脱氢酶催化的是碳-碳键的氧化；
④琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸的脱氢具有严格的立体专一性。
（3）琥珀酸脱氢酶的调节
丙二酸与琥珀酸脱氢酶的底物在结构上相类似，其可以与琥珀酸脱氢酶结合，但琥珀酸脱氢酶却不能催化其脱氢，因此丙二酸是琥珀酸脱氢酶的强抑制剂，能抑制细胞呼吸。
（4）琥珀酸脱氢酶中的铁硫聚簇
①琥珀酸脱氢酶中含有三种不同的铁硫聚簇：
a．一种是两个铁原子结合到两个无机硫化物上，用2Fe-2S表示；
b．另外两种是3个铁原子和4个铁原子结合到4个无机硫化物上，用3Fe-4S和4Fe-4S表示。
②琥珀酸脱氢酶是直接连在电子传递链上的，由琥珀酸分子上脱下的氢即形成FADH2，后者直接将电子传递给酶分子的Fe-S。在氧化磷酸化的电子传递反应中以及在光合作用中都起着重要的作用。
7．延胡索酸水合形成L-苹果酸
（1）反应式
（2）延胡索酸酶
催化延胡索酸水合形成苹果酸的酶称为延胡索酸酶。该酶的催化反应具有严格的立体专一性质，只能形成L-苹果酸。
8．L-苹果酸脱氢形成草酰乙酸
（1）苹果酸脱氢酶
L-苹果酸的羟基氧化形成羰基，催化这个反应的酶称为苹果酸脱氢酶。它的辅酶是NAD＋。
（2）所有已知的脱氢酶的共同性质
①具有立体结构的专一性；
②都以NAD＋作为电子受体；
③NAD＋的腺嘌呤核苷部分都是结合在酶的疏水裂缝中；
④烟酰胺与酶结合是使其发挥活性作用的部分暴露在极性环境中，不发挥活性的其他部分还是与酶的疏水基团相接；
⑤与酶结合的NAD＋分子呈现伸展的构象形式。
四、柠檬酸循环的化学总结算
1．柠檬酸循环的总化学反应式
2．柠檬酸循环中的能量计算
表23-2 柠檬酸循环中产生的ATP
表23-3 柠檬酸循环的总结算
五、柠檬酸循环的调控
1．柠檬酸循环本身制约系统的调节
（1）酶的调控
柠檬酸循环中柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶是反应的关键酶。
23-4 柠檬酸循环的酶调控
（2）底物的调控
柠檬酸循环中酶的活性主要靠底物提供的情况推动，并受其生成产物浓度的抑制。循环中最关键的底物为乙酰-CoA、草酰乙酸和产物NADH。
2．ATP、ADP和Ca2＋对柠檬酸循环的调节
（1）ATP和ADP
ADP是异柠檬酸脱氢酶的变构促进剂，从而增加了该酶对底物的亲和力。机体活动处于静息状态时，ATP的消耗下降、浓度上升，对异柠檬酸脱氢酶产生抑制效应。
（2）Ca2＋
Ca2＋刺激糖原的降解、启动肌肉收缩，还对许多激素的信号起中介作用，在柠檬酸循环中对丙酮酸脱氢酶磷酸酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶都有激活作用。
图23-4 乙酰-CoA形成和柠檬酸循环中的激活和抑制部位示意图
图中表示ADP和Ca2＋为激动剂，NADH、ATP为抑制剂
六、柠檬酸循环的双重作用
柠檬酸循环是绝大多数生物体主要的分解代谢途径，也是准备提供大量自由能的重要代谢系统，在许多合成代谢中都利用柠檬酸循环的中间产物作为生物合成的前体来源，因此，柠檬酸循环具有分解代谢和合成代谢双重性或称两用性（如图23-5）。
图23-5 柠檬酸循环的双重作用