1-4 扫描电子显微镜样品制备及观察
【实验目的】
1.掌握扫描电子显微镜的结构及工作原理；
2.了解扫描电子显微镜样品的制备方法；
3.了解扫描电子显微镜的操作步骤。
扫描电镜可分为普通电子显微镜、分析型扫描电子显微镜和场发射枪扫描电子显微镜三类。它是一种用于观察物体表面结构的电子光学仪器，具有放大倍数可调范围宽、图像分辨率高、景深大等特点。1935年德国科学家Knoll首次提出其概念，1952年剑桥大学Oatley等制作了第一台扫描电镜，1965年剑桥大学推出第一台商品扫描电镜。目前扫描电镜的最高分辨率可达0.6nm，放大率达80万倍。
扫描电镜主要用于观察样品的表面三维立体形貌，其样品制备过程简单，导电样品或新鲜生物样品可以直接进行观察。即使高含水量的生物样品，也只需经过固定、脱水、干燥和喷金四步处理即可进行观察。样品尺寸可达2cm3。
如图1-4-1所示，从结构上看，扫描电镜主要由电子光学系统（镜筒）、电子信号收集与处理系统、电子信号显示与记录系统、真空系统和电源系统五个部分组成。工作原理为：电子枪在高温下产生自由电子，经电场加速和磁透镜聚焦形成扫描电子束，电子束在样品表面扫描激发产生电子信息，电子信息经传递放大最终经显像管成像。
图1-4-1 扫描电镜结构示意图
在真空环境下，如图1-4-2所示，在2～30 kV加速电压作用下，电子枪可发出几十微米直径的电子束，经第一、第二聚光镜缩小成直径几纳米的入射电子束，在扫描线圈产生的磁场作用下，入射电子束按一定时间、空间顺序做光栅式扫描。
当电子束轰击导电样品表面时，电子与构成样品表面物质的元素的原子核及外层电子发生单次或多次弹性或非弹性碰撞，一些电子被反射出样品表面，而其余的电子则渗入样品中，逐渐失去其动能，最后停止运动，被样品吸收。在此过程中有99%以上的入射电子能量转变成样品热能，而其余约1%的入射电子从样品中激发出各种信号。这些信号主要包括二次电子、背散射电子、吸收电子、透射电子、俄歇电子、阴极发光、X射线等。其中的二次电子经加速并射到闪烁体上，使二次电子信息转变成光信号，光信号经过光导管进入光电倍增管，再转变成电信号。电信号经视频放大器放大，并被输入到显像管的栅极中，调制荧光屏的亮度。显像管中的电子束在荧光屏上也作光栅状扫描，且这种扫描运动与样品表面电子束扫描运动严格同步，所以，由探测器逐点检测的电子信号，将一一对应调制显像管相应点的亮度，荧光屏显示的即与样品形貌一致的图像。
图1-4-2 扫描电镜原理图
扫描电镜样品制备比透射电镜样品制备简单。除要求完整的保存样品表面形貌结构外，只要求样品干燥并能导电，而无须包埋和切片。生物样品制备一般包括固定、脱水、干燥和喷涂金属膜（以下简称喷金）四个步骤。
对于干燥且质地坚硬的样品，如牙齿、毛发、指甲、骨骼，昆虫外骨骼和触角等，只需经过简单处理，除去灰尘及黏液等污物即可在电镜下观察，无须固定、脱水、干燥和喷金。
对于细胞样品，可直接将其培养在盖玻片上，使用去污剂抽提细胞膜和细胞质，干燥后无须喷金即可观察。
对于含水量高的动植物样品，必须经过固定、脱水、干燥和喷金处理才可观察。固定液的选择可参考透射电镜固定液的标准，但对于大部分动植物样品，使用FAA或戊二醛固定液充分渗透，实现固定即可，无须后固定。
脱水剂为乙醇或丙酮，采用梯度脱水的方法将样品中的水分逐步置换为乙醇或丙酮。脱水时间应根据样品体积与渗透性进行相应调整，对于体积大、渗透性小的样品应延长各梯度脱水剂的渗透时间，反之亦然。
充分脱水后，使用临界点干燥技术对样品进行快速干燥，该方法利用液体在临界状态下，气-液相界消失且表面张力为零的特性，消除了液体表面张力在干燥过程中对样品表面结构的破坏作用，实现无形变的样品干燥。由于直接干燥含水样品或是经脱水剂处理后的样品所需的临界条件过高（水的临界温度374℃，临界压力21.39MPa；乙醇的临界温度243.1℃，临界压力6.38MPa；丙酮的临界温度236.5℃，临界压力4.78MPa），会造成样品表面的严重破坏，因此不能直接进行临界点干燥，而需使用临界温度和压力均较低的液体作为媒介液，先置换样品中的脱水剂，再创造临界温度和压力进行临界点干燥。在扫描电镜样品干燥中，最普遍使用的媒介液是二氧化碳，其临界温度为31℃，临界压力为7.14MPa，在此温和条件下，样品表面形貌可完好保存。经脱水剂处理的样品可直接与液体二氧化碳置换，随后进行临界点干燥。由于脱水剂与二氧化碳互溶性较差，而与乙酸异戊酯互溶性较好，因此，样品脱水后往往需要通过梯度过渡的方式置换到乙酸异戊酯溶液中，随后再进行二氧化碳临界点干燥。
干燥后的生物样品，由于不能导电，还需进行金属喷涂后才可观察。目前普遍使用的喷涂金属为金，喷涂厚度约10nm。喷金方法主要有真空喷涂法和离子溅射法。
【试剂与器材】
1.0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）配方：
（1）甲液（0.2mol/L Na2HPO4）配方：Na2HPO4·12H2O71.64g/L；
（2）乙液（0.2mol/L NaH2PO4）配方：NaH2PO4·2H2O31.21g/L｡
表1-4-1 0.2mol/L PBS配方
根据实验要求的pH，取xmL甲液与ymL乙液，混合均匀即得相应pH的PBS溶液。如，0.2mol/L PBS（pH7.0）：甲液30.5mL+乙液19.5mL，混匀，4℃存放。
2.2.8%戊二醛（50mL）：0.2mol/L PBS（pH7.0）25mL，25%戊二醛5.6mL，加水定容至50mL，加Triton X-10025μL。
3.FAA固定液（100mL）：酒精50mL，37%甲醛溶液10mL，冰醋酸5mL。
4.脱水剂：无水乙醇（分析纯）或丙酮（分析纯）。
5.乙酸异戊酯（分析纯）。
6.液体二氧化碳：纯度达99.99%。
1.取材及固定用器材：镊子，抽气用针筒或真空泵，封口膜。
2.干燥用器材：临界点干燥仪，本实验方法以LEICA公司出品的全自动临界点干燥仪（Automated Critical Point Dryer）EM CPD300为例（视频资料参见官网：http：//www.leica-mi-crosystems.com/products/em-sample-prep/biological-specimens/room-temperature-techniques/dr-ying/details/product/leica-em-cpd300/showcase/），干燥盒，镊子，铅笔，滤纸。
3.喷金用器材：喷金机，本实验方法以JEOL公司出品的自动喷金机（Auto Fine Coater）JFC-1600为例。
【实验步骤】
对于新鲜生物样品，可即时取材即时进行扫描电镜观察。对于不能立即观察的含水量高的生物样品则需进行系列处理。本实验方法将以常见的含水量高的生物样品为例进行介绍。
取材后，应立即对样品进行固定，与透射电镜相比，扫描电镜一般无须进行后固定。具体操作方法如下：
1.将样品浸泡于FAA固定液或2%～3%的戊二醛固定液中。对于植物材料，由于细胞壁和液泡阻碍固定液迅速渗入，一般需用真空泵抽气2～4h，或用针筒快速抽气约30min，具体处理时间因样品幼嫩程度而异。一般判断标准是恢复到正常大气压后，样品能沉入固定液底部即可。
2.更换新的固定液，4℃固定过夜。
使用梯度浓度的有机溶剂处理，将样品中的水分置换出来。一般选取乙醇（或丙酮）。按照如下梯度处理：50%乙醇15min→60%乙醇15min→70%乙醇15min（可在此步短暂存放样品，保存于4℃）→80%乙醇15min→90%乙醇15min→100%乙醇15min，最后应在100%乙醇中多次脱水，每次15min。
梯度脱水时间也因样品幼嫩程度而异，对于表面附有蜡质、较硬或机械强度较大的样品可以适当延长脱水时间；
使用临界点干燥仪干燥样品，首先将样品放入液态二氧化碳内加热，使其温度达到临界点以上，当样品内外液体均处于完全气化状态时，继续保持临界温度。随后将压力缓慢降至大气压，此时气化的液体将继续维持气态，排出后即可获得无形变的干燥样品。具体操作方法以Leica EM CPD300全自动临界点干燥仪为例（图1-4-3）：
图1-4-3 Leica EM CPD300全自动临界点干燥仪
1.将样品放入样品盒：每个样品盒需准备2片圆形滤纸，尺寸略大于样品盒底面。将滤纸放入样品盒，上下各1片，使其围住样品盒内侧。用铅笔在滤纸上写明样品编号。从乙醇或乙酸异戊酯中取出样品放入样品盒，注意放置过程须使样品始终处于被乙醇或乙酸异戊酯浸没的状态。
2.预冷干燥室：接通电源，将样品盒放入干燥室，倒入脱水剂没过样品盒。设置预冷程序，将温度降至10～15℃。
3.进气与置换：缓慢打开二氧化碳储气瓶阀门及干燥仪进给阀（点击CO2IN键），注入液体二氧化碳，当二氧化碳与脱水剂体积比达到1:1时，关闭进给阀（再次点击CO2IN键）。打开排出阀（按Exchange键），直到腔内液体体积减少到圆窗底部，停止交换（再次按Exchange键）。初步置换完成后，浸润样品盒的脱水剂被有效去除，接下来仍须立刻进行两次置换，使二氧化碳与样品内的脱水剂充分置换。具体操作是，打开进给阀（点击CO2IN键），注入二氧化碳至圆窗顶部，停止注入，停留15～30min。打开排出阀，待腔内液体减少至圆窗底部时关闭排出阀。重复注入二氧化碳，再次打开进给阀，注入二氧化碳至圆窗顶部，停止注入，停留15～30min，打开排出阀，待腔内液体减少至圆窗底部时关闭排出阀（图1-4-4）。
图1-4-4 干燥仪控制界面
4.气化与排气：设置腔内温度至35℃（点击Heat键），升温过程约耗时10min，此时气压约为7.16MPa（Pc显示约78 bar），二氧化碳处于临界状态，停留2min。通过玻璃窗可观察到腔内二氧化碳蒸气的变化情况，开始时玻璃窗上出现的蒸气珠较大，分布较稀疏，随后蒸气珠变得细小而密集。当玻璃窗被乳白色雾状蒸气笼罩后，瞬间又变得清亮时，表明干燥室内二氧化碳液体已全部被气化。打开排气阀（点击Gas OUT键），放气完毕，Pc显示1 bar。
5.取样：关闭二氧化碳气瓶，缓慢旋开干燥室盖子，取出样品盒。
6.关闭电源，盖好盖子，防止进灰。
此时样品为白色，且非常干燥脆弱，须小心转移。
喷金方法主要有真空喷涂法和离子溅射法，由于离子溅射法具有用时短，易掌握金属喷涂厚度的优点，故为目前广泛采用。离子溅射仪是利用辉光放电的物理现象使金属溅射到样品表面。溅射腔内只需低真空（约0.1Pa）即可进入工作状态，喷金厚度可根据所加电压和电流大小及喷涂时间决定。电流小，喷金细腻，耗时长；电流大，喷金粗大，耗时短。现以JEOL公司生产的JFC-1600喷金机为例介绍具体操作。
1.放置样品。
在样品台上贴好导电双面胶，将干燥后的样品粘于样品台上，粘样时应根据实验目的将样品的观察面尽量向上。取下喷金机盖子放在胶垫上，将粘好样品的样品台放在喷金机托盘上，盖好盖子。
2.仪器操作。
仪器操作面板如图1-4-5：
图1-4-5 仪器操作面板
（1）打开电源；
（2）设置喷金时间：按DISPLAY，选sec，按上、下键，将喷金时间设置为30s，喷金时间可适当调整；
（3）设置喷金电流：直接点击“电流”按钮选择喷金电流，一般选择20或30mA，然后将灯丝电流慢慢开至锁定的位置；
（4）设置喷金电压：按DISPLAY，选Pa。当腔内气压小于25Pa时，液晶屏开始显示内部气压，按MODE选AUTO；
（5）抽真空及喷金：气压小于20Pa时，可按START，喷金机将自动抽真空3次。当气压小于2Pa时，自动开始镀金，这时可观察到紫红色辉光放电。待START指示灯熄灭，镀金结束；
（6）关闭电源，取出样品，盖好盖子。
1.样品台放置与电镜开机：将喷过金的粘有样品的样品台放入电镜室，打开电镜，电镜开机一般需要先打开稳压器和冷凝水，最后将电镜打开（不同厂家的电镜开机方式有差别，须经专业电镜操作人员讲解后再操作）。电镜启动后，往往需等待一段时间，供电镜室抽真空，达到真空度后，灯丝即处于可启动的状态。
2.样品观察：转动样品台移动把手，调整放大倍数（从最小慢慢增大），寻找要观察的视域，仔细调整焦距、消像散、调节亮度、对比度直到获得最满意的图像，拍照记录。
1.保持电镜室高真空度的前提下，首先关闭操作系统电源，然后关闭电镜，最后关闭稳压器电源。
注意：不同厂家不同型号电镜关机顺序有差别，须经专业电镜操作人员讲解后再操作。
2.一般15min后关闭冷却水。
【结果与分析】
制样结束后，原本纯白的样品会覆盖一层深灰色、具金属光泽的颗粒层，这时可以放入扫描电镜样品仓进行观察。对于表面形貌复杂的样品，可从不同角度多次喷金，以求样品各侧面均有金粉覆盖。还可适当对样品进行解剖，将待观察部位尽量暴露在外。结果示例：
1.植物花粉。
直接喷金即可观察，如图1-4-6所示，亮度与对比度的调节标准可概括为使图片最亮处呈柔和的白色而非亮白，背景部分则尽量呈黑色。亮度的最低值应保证不丢失样品细节，在此亮度下，通过适当调整对比度，可呈现如图所示的沟壑立体的效果。
图1-4-6 植物花粉扫描电镜照片
（图片由北京大学饶广远实验室李霞提供）
2.蕨类植物精子器及螺旋鞭毛精子。
经过固定、干燥、喷金制样后进行观察，由于该器官表面并无丰富立体结构，所以需适当提高亮度，以保证不丢失细节，在此基础上适当调节对比度，呈现该器官完整表面样貌（图1-4-7）。
1-4-7 蕨类植物精子器及螺旋鞭毛精子扫描电镜照片
【注意事项】
样品的制备，应达到以下要求：
1.尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。
2.在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。
3.样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。
【参考文献】
1.付洪兰.2004.实用电子显微镜技术.北京：高等教育出版社.
2.陈力.1998.生物电子显微技术教程.北京：北京师范大学出版社.
3.西门纪业，葛肇生.1979.电子显微镜的原理和设计.北京：科学出版社.