第5章 荧光分析法
【本章教学要求】
● 掌握荧光光谱产生的过程及基本原理、荧光发射光谱和激发光谱的光谱特征、荧光强度和分子结构的关系及影响荧光强度的外界因素、荧光强度与浓度的关系。
● 熟悉荧光和磷光的区别、荧光效率和荧光寿命的概念、荧光光度计的主要构造、荧光分析的基本方法。
● 了解荧光分析的应用及荧光分析新技术。
【导入案例】
1575年，有人在阳光下观察到菲律宾紫檀木切片的黄色水溶液呈现极为可爱的天蓝色。1852年斯托克斯（G.G.Stokes）用分光计观察奎宁和叶绿素溶液时，发现它们所发出的光的波长比入射光的波长稍长，由此判明这种现象是由于这些物质吸收了光能并重新发出不同波长的光线，斯托克斯称这种光为荧光。人们可以将试样与已知物质同时放在紫外光源下，根据它们所发荧光的性质、颜色和强度，鉴定它们是否含有同一物质。也可用荧光分光光度计测量物质在某一波长处的荧光强度，进而计算出被测物的含量。例如将维生素B1在碱性溶液中被氰化钾氧化成硫色素后，快速异丁醇振摇提取，在激发波长为365nm照射下记录发射波长为435nm下的荧光强度，通过与对照品荧光强度比较可求出维生素B1的含量。
一些物质被某种波长激发光照射后，能选择性吸收特定波长的能量，并发射出比原吸收波长更长的光，这种现象为光致发光。当激发光停止，所发射的光也立即消失，这种光称为荧光（fluorescence）。根据激发光的波长范围不同，可分为X射线荧光、紫外-可见荧光、红外荧光等。根据发射荧光的粒子不同，可分为分子荧光、原子荧光。基于对物质荧光的测定而建立起来的定性和定量分析方法称为荧光分析法（fluorometry）或荧光分光光度法。本章主要介绍激发光源为紫外-可见的分子荧光分析法。
荧光分析法具有以下优点：①灵敏度高，由于在黑背景下测定荧光发射强度，荧光分析法较吸收光度法灵敏度高出2～3个数量级，可达10-10～10-12g/mL；②选择性强，光谱干扰少，可以通过选择适当的激发和发射波长来实现选择性测量的目的；③线性范围宽，荧光分析法线性范围为3～5个数量级，而吸收光度法线性范围仅为1～2个数量级；④试样用量小、操作方便，荧光分析法在药学、生物化学、临床、食品及环境等分析中具
有特殊的重要性，特别是联用技术更扩大了荧光分析法的应用范围。
荧光分析法的不足——不是所有吸光物质都能产生荧光，因此其应用也受到一定程度上的限制。