3.5　定性与定量分析方法

3.5.1　定性方法

利用紫外光谱对有机化合物进行定性鉴别的主要依据是吸收光谱的形状，吸收峰的数目，各吸收峰的波长、强度和相应的吸收系数等。通常采用比较的方法进行鉴别，即将测定样品与对照品的紫外光谱进行对照、比较；也可以将测定样品与文献所载的紫外标准图谱进行比较。

（1）比较吸收光谱

两个化合物如果相同，则其吸收光谱应完全一致。可将试样与对照品用同样的方法配制成相同浓度的溶液，分别测定其吸收光谱，然后比较光谱图是否完全一致，从而加以判断。

例如醋酸可的松、醋酸氢化可的松与醋酸泼尼松的λmax（240nm）、ε值（1.57×104）与值（390），几乎完全相同，但从它们的吸收曲线（图3-19）上可以看出某些差别，据此可以得到鉴别。

（2）比较吸收光谱的特征数据

最常用于鉴别的光谱特征数据是吸收峰所在的波长λmax。若一个化合物中有几个吸收峰，并存在吸收谷或肩峰，可同时作为鉴定依据。

具有不同或相同发色团与助色团的不同化合物，可能具有相同的λmax值。但由于它们的分子量不同，所以ε或存在着差别，可以作为鉴别的依据。

例如安宫黄体酮（M=386.5）和炔诺酮（M=298.4）

安宫黄体酮（M=386.5）　　　　　　　　炔诺酮（M=298.4）

λmax=（240±1）nm，　　　　　　　　 λmax=（240±1）nm，=571

（3）比较吸光度比值

有些化合物不只一个吸收峰，可用在不同吸收峰（或峰与谷）处测得吸光度的比值A1/A2或ε1/ε2作为鉴别的依据。

例如《中华人民共和国药典》（2015年版）对维生素B12采用下述方法鉴别：将检品按规定方法配成25μg/mL的溶液，分别测定278nm、361nm和550nm处的吸光度A1、A2和A3，A2/A1应为1.70～1.88；A2/A3应为3.15～3.45。

3.5.2　单组分定量方法

常用的单组分定量分析方法有标准曲线法、标准对照法、吸收系数法等。

（1）标准曲线法

标准曲线法又称工作曲线法或校正曲线法。本法在药物分析中应用广泛，简便易行，而且对仪器精度的要求不高。

首先配制一系列不同浓度的标准溶液，在相同条件下分别测定吸光度。以浓度为横坐标、相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，如图3-20所示，计算吸光度与浓度的回归方程。然后在相同的条件下测定供试液的吸光度，从标准曲线或回归方程中求出被测组分的浓度。制备一条标准曲线至少需要5～7个点，并不得随意延长；待测液浓度必须包括在标准曲线浓度范围内，否则应进行适当调整；供试品溶液和对照品溶液必须在相同的操作条件下进行测定。理想的标准曲线应该是一条通过原点的直线。实际上，有的标准曲线可能不通过原点。其原因主要包括空白溶液的选择不当、显色反应的灵敏度不够、吸收池的光学性能不一致等几方面，应当采取适当措施加以改善。

（2）标准对照法

在相同条件下配制对照品溶液和供试品溶液，在选定波长处，分别测定其吸光度，根据Beer定律计算供试品溶液中被测组分的浓度。

计算公式为

A标=Elc标

A样=Elc样

因对照品溶液和供试品溶液是同种物质，两者在同台仪器及同一波长处且于厚度相同的吸收池中进行测定，故a和b均相等，所以

　　（3-10）

　　（3-11）

标准对照法应用的前提是制备的标准曲线应通过原点。

（3）吸收系数法

根据Beer定律A=Elc，若l和吸收系数已知，且大于100，即可根据供试品溶液测得的A值求出被测组分的浓度。

　　（3-12）

【例1】　维生素B12的水溶液在361nm处的值是207，盛于1cm吸收池中，测得溶液的吸光度为0.457，则溶液浓度为：

c=0.457/（207×1）=0.002g/100mL

应注意计算结果是100mL中所含质量（g），这是由百分吸收系数的定义所决定的。

通常可以从手册、文献或药典中查到；也可将供试品溶液吸光度换算成样品的百分吸收系数，然后与纯品（对照品）的吸收系数相比较，求算样品中被测组分含量。

【例2】　维生素B12样品25.0mg用水溶成1000mL后，盛于1cm吸收池中，在361nm处测得吸光度A为0.516，则：

3.5.3　多组分定量方法

若样品中有两种或两种以上的组分共存时，可根据吸收光谱相互重叠的情况分别采用不同的测定方法。最简单的情况是各组分的吸收峰不重叠，如图3-21（a）所示。我们可按单组分的测定方法分别在λ1处测a组分的浓度，在λ2处测b组分的浓度。

第二种情况是a、b两组分的吸收光谱有部分重叠，如图3-21（b）所示。在a组分的吸收峰λ1处b组分没有吸收，而在b组分的吸收峰λ2处a组分有吸收。可先在λ1处按单组分测定法测出混合物中a组分的浓度ca，然后在λ2处测得混合物的吸光度，最后根据吸光度的加和性原理计算出b组分的浓度cb。

　　（3-13）

在混合物的测定中最常见的情况是各组分的吸收光谱间相互重叠，如图3-21（c）所示。原则上，根据吸光度具有加和性的原理，只要各组分的吸收光谱有一定的差异，都可以设法进行测定。特别是近年来计算分光光度法的推广运用及计算机技术的普及，各种测定新技术不断出现，为药物分析提供了行之有效的测试手段和方法。下面介绍几种已在药物及其制剂含量测定方面得到广泛应用的方法。

①解线性方程组法　吸收光谱相互重叠的两组分，若事先测出λ1与λ2处两组分各自的吸收系数E或ε，再在两波长处分别测得混合溶液吸光度与，当b为1cm时，即可通过解线性方程组法计算出两组分的浓度，如图3-21（c）所示。

　　（3-14）

　　（3-15）

解得

　　（3-16）

　　（3-17）

采用这种方法进行定量分析时，要求两个组分浓度宜相近，否则误差较大。

②双波长分光光度法　吸收光谱重叠的a、b两组分混合物中，若要消除b组分的干扰以测定a组分，可从干扰b组分的吸收光谱上选择两个吸光度相等的波长λ1和λ2，然后测定混合物的吸光度差值，最后根据ΔA值来计算a组分的含量。

　　（3-18）

等吸收点法的关键之处是两个测定波长的选择，其原则是必须符合以下两个基本条件：①干扰组分b在这两个波长处应具有相同的吸光度，即ΔAb=-=0；②被测组分在这两个波长处的吸光度差值ΔAa应足够大。下面用作图法说明两个波长的选定方法。如图3-22所示，a为待测组分，可以选择组分a的最大吸收波长作为测定波长λ2，在这一波长位置作x坐标轴的垂线，此直线与干扰组分b的吸收光谱相交于某一点，再从这一点作一条平行于x坐标轴的直线，此直线可与干扰组分b的吸收光谱相交于一点或数点，则选择与这些交点相对应的波长作为参比波长λ1。当λ1有若干波长可供选择时，应当选择使待测组分的ΔA尽可能大的波长。若待测组分的最大吸收波长不适合作为测定波长λ2，也可以选择吸收光谱上其他波长，关键是要能满足上述两个基本条件。

根据式（3-18）被测组分a在两波长处的ΔA值愈大愈有利于测定。同样方法可消去a组分的干扰，测定b组分的含量。

多组分定量方法还有：三波长分光光度法、差示分光光度法、导数分光光度法、薄层扫描紫外光谱法、光声光谱法、热透镜光谱分析法、催化动力学分光光度法、速差动力学分光光度法、流动注射分光光度法以及化学计量学辅助的紫外分光光度法等，这些方法大都可用于药物分析的含量测定之中。计算机技术、化学信息学的发展，大大加快了分光光度法的发展，使得分光光度法成为一种快速、准确、可靠的多组分混合物分析方法。