第三节　灭菌方法与无菌操作

一、概述

灭菌与无菌操作的主要目的是：在最大限度地保证药物制剂安全性和临床疗效的同时，尽可能杀灭或除去微生物繁殖体和芽孢。根据各种制剂或生产环境对微生物的限定要求不同，可采取不同的措施进行处理，如灭菌、除菌、防腐、消毒和无菌操作。

灭菌（sterilization）系指采用物理或化学方法将所有微生物、繁殖体和芽孢全部杀灭的技术。

除菌（debacteria）系指利用过滤介质或静电法将细菌截留而除去的技术。

防腐（antisepsis）即抑菌，系指采用化学药品或低温防止和抑制微生物生长与繁殖的技术。

消毒（disinfection）系指采用物理或化学方法杀灭病原微生物的技术。

微生物的种类不同，灭菌方法不同，灭菌效果也会有差异。细菌的芽孢具有较强的抗热能力，因此灭菌的效果常以杀灭芽孢为准，但不能保证物料绝对无菌。无菌操作工艺只用于某些特定产品的生产，从药品、人员、器具、空气和环境等制剂生产过程中的各个环节应保持没有微生物污染的严格无菌状态。

无菌药品包括无菌制剂和无菌原料药，按生产工艺可分为采用最终灭菌工艺的最终灭菌产品和采用无菌生产工艺的非最终灭菌产品。在物料允许的条件下，要尽可能采用最终灭菌工艺。灭菌的方法分类如图3-3所示。

二、灭菌工艺参数

药品的质量标准对于保证药品质量具有重要的意义，但是无菌检验方法存在一定的局限性。充分了解灭菌动力学，可以更好地设计灭菌方法并对其进行合理的验证，以提高灭菌的质量水平。以下介绍几个重要的灭菌参数。

（一）D值与Z值

1.D值

在一定温度下，杀灭90%微生物（或残存率为10%）所需的灭菌时间。研究表明，灭菌时微生物死亡的速度可以用一级动力学过程来描述：

　　（3-1）

或

　　（3-2）

式中，N0为原有微生物数；Nt为灭菌时间为t时残存的微生物数；k为杀灭速度常数。

lgNt对t作图得一直线，，令斜率的负倒数为D值，即：

　　（3-3）

由式（3-3）可知，当lgN0-lgNt=1时，D=t，即D值为被灭菌物品中微生物数降至原来的1/10或降低一个对数单位（lg100降至lg10）所需的时间，如图3-4所示。

D值越大，表明该温度下微生物的耐热性越强；微生物的种类、所处环境、灭菌方法、灭菌温度不同，D值也不同；在其他条件固定的情况下，D值随灭菌温度的升高而降低。见表3-8。

2.Z值

在控制灭菌温度时，为了确保灭菌的效果，必须了解该温度下微生物的D值，同时也应了解温度变化对于D值的影响。当灭菌温度升高时，速度常数k增大，而D值（灭菌时间）随温度的升高而减少。在一定温度范围内（100～138℃），lgD与温度T呈线性关系。

令

　　（3-4）

由式可知，Z值为降低一个lgD值所需升高的温度数，即灭菌时间减少到原来的1/10所需升高的温度，或在相同灭菌时间内，杀灭99%的微生物所需提高的温度，如图3-5所示。如Z=10℃，意思是灭菌时间减少到原来灭菌时间的10%，且具有相同的灭菌效果，所需升高的灭菌温度为10℃。式（3-4）可以改写为：

　　（3-5）

设Z=10℃，T1=110℃，T2=121℃，则D2=0.079D1。即110℃灭菌1min与121℃灭菌0.079min，灭菌效果相当。若Z=10℃，灭菌温度每增加1℃，则D1=1.259D2，即温度每升高1℃，灭菌速率相应提高25.9%。Z值越大，微生物对灭菌温度变化的敏感性越弱，期望通过提高温度来减少灭菌时间的效果越不明显。

（二）F值与F0值

为了保证终产品的无菌效果，目前多采用F与F0值来验证灭菌的可靠性。

1.F值

为在一定温度T下，给定的Z值产生的灭菌效果与参比温度T0下产生的灭菌效果相同时所相当的时间（equivalent time），以min为单位。即整个灭菌过程的效果相当于温度T0下F时间的灭菌效果。其数学表达式：

　　（3-6）

式中，Δt为测量被灭菌物品温度的时间间隔，一般为0.5～1.0min或更小；T为每个时间间隔Δt所测量被灭菌物品的温度；T0为参比温度。

2.F0值

在湿热灭菌时，参比温度为121℃，以嗜热脂肪芽孢杆菌作为微生物指示菌，该菌在121℃时，Z值为10℃。即：

　　（3-7）

式中，F0为在一定灭菌温度T、Z值为10℃所产生的湿热灭菌效果与121℃、Z值为10℃所产生的灭菌效果相同时所相当的时间，min。也就是说，不管温度如何变化，t时间产生的灭菌效果相当于温度在121℃下灭菌F0（min）的效果，即它把所有温度下的灭菌效果都转化为121℃下灭菌的等效值。因此称F0值为标准灭菌时间（min）。按式（3-7）定义的F0值又称为物理F0值，目前F0值常用于热压灭菌。

灭菌过程中，只需记录被灭菌物品的温度和时间，就可算出F0。假设记录的数据如表3-9所示，Δt为1min，即每分钟测量一次温度。

用式（3-7）计算如下：

计算结果表明，44min内一系列温度下的灭菌效果相当于在121℃灭菌8.49min的灭菌效果。

影响F0值的因素主要有：①容器大小、形状及热的穿透性；②被灭菌物品溶液的性质、填充量；③容器在灭菌器中的数量及分布等。

为了确保灭菌效果，还应注意两个问题，根据F0=D121×（lgN0-lgNt）可知，若N越大，即被灭菌物中微生物越多，则灭菌时间越长，故生产过程中应尽量减少微生物的污染，应采取各种措施使每个容器的含菌数控制在10个以下（即lgN0≤1）。其次，考虑到安全因素，在计算F0值时，一般增加50%的F0值，如规定F0为8min，则实际操作应控制F0为12min。

三、物理灭菌法

物理灭菌法系指采用加热、射线和滤过等物理手段杀灭或者除去微生物的技术。

（一）热力灭菌法

该法采用加热的方法破坏蛋白质和核酸中的氢键，导致蛋白质变性凝固，核酸破坏，酶失去活性，最终导致微生物死亡，是最常用和最可靠的灭菌法。热力灭菌法又可分为干热灭菌法和湿热灭菌法。

1.干热灭菌法

干热灭菌法系指利用干热空气或火焰进行灭菌的方法，即分为干热空气灭菌法和火焰灭菌法。该法适用于耐高温但不耐湿热的物品和用具的灭菌，如金属、玻璃及瓷器、纤维制品和液体石蜡等。

（1）干热空气灭菌法　系指在高温干热空气中灭菌的方法。在干燥条件下，微生物的耐热性较强，所以必须延长受高热的时间才能实现灭菌的目的。《中国药典》现行版规定，干热空气灭菌条件一般为160～170℃ 120min以上，170～180℃ 60min以上，250℃ 45min以上，也可采用其他温度和时间参数。250℃灭菌45min可除去产品中的热原。采用干热灭菌时，为保证灭菌的均一性和有效性，被灭物品不能排列过密。无论采用何种灭菌条件，均应保证灭菌后物品的SAL≤10-6。本法的缺点是对灭菌温度的要求较高，穿透力弱，灭菌时间较长，不适用于橡胶、塑料及大部分药品。

（2）火焰灭菌法　系指直接在火焰中灼烧灭菌的方法。该法灭菌迅速、可靠、简便，适用于耐火焰材质的物品与用具的灭菌，不适用于药品的灭菌。

采用干热灭菌法灭菌时应注意以下问题：①灭菌的玻璃器皿上不可有水，否则干热灭菌的过程中容易炸裂；②被灭菌物品不能装得太满，以保证灭菌温度均匀上升；③降温操作时，应待温度自然降至60℃以下才能打开箱门取出物品，否则骤然降温易导致玻璃器皿炸裂。

2.湿热灭菌法

湿热灭菌法系指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，以高温高压水蒸气为介质，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，最终导致微生物的死亡，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是热力灭菌中应用最广泛的方法，也是国内制药工业普遍采用的方法。

湿热灭菌的条件通常为126℃ 15min、121℃ 30min、116℃ 40min。但也可采用其他温度和时间参数，无论采用哪种参数，都必须要确保物品灭菌后的SAL≤10-6。对热稳定的物品，灭菌工艺首选过度杀灭法；对热不稳定的物品，灭菌工艺的确定要依赖于其耐热性和灭菌前微生物的污染水平。

（1）热压灭菌法　系指采用高压饱和水蒸气加热杀灭微生物的方法。由于蒸汽的潜热大、穿透力强，能杀死所有的细菌繁殖体和芽孢，因此具有很好的灭菌效果。凡能耐高压蒸汽的制剂和容器均可用此法。常用的热压灭菌器有手提式热压灭菌器、立式热压灭菌器和卧式热压灭菌柜。国内大多数注射剂车间配备的灭菌器在灭菌过程中已实现自动化，可自动记录灭菌温度和时间，计算出F0值，判断是否灭菌完全。表3-10为不同热压条件和达到过度杀灭所需的时间。

（2）流通蒸汽灭菌　系指在常压下使用100℃流通蒸汽加热杀灭微生物的方法。灭菌时间通常为30～60min，此法适用于不耐高热的物品灭菌，这种方法不能杀灭所有的芽孢，一般作为不耐热无菌产品的辅助灭菌手段。

（3）煮沸灭菌法　系指将待灭菌物品放入沸水中加热灭菌的方法。煮沸时间一般为30～60min，该法灭菌效果差，在用其进行注射器和注射针等器皿的消毒时，常需加入抑菌剂，如苯酚、甲酚、三氯叔丁醇等，以提高灭菌效果。

（4）低温间歇灭菌法　系指将待灭菌的物品置于60～80℃的水中或流通蒸汽中加热1h，在室温下放置24h，使残存的芽孢发育成繁殖体，再次进行加热将其杀灭。如此反复进行多次，直至杀灭所有芽孢。该法适用于不耐高热的物品灭菌。其缺点是：费时低效、对芽孢的杀灭效果不理想，必要时要加适量的抑菌剂。

影响湿热灭菌的因素有以下几个方面。①灭菌温度和时间：一般来说，灭菌的温度和时间与药物的分解速度有关。温度升高，时间延长可提高灭菌效果，但药物的分散速度随之加快。为保证药物的稳定性和有效性，应在达到有效灭菌的前提下选择较低的灭菌温度和较短的灭菌时间。②蒸汽的性质：蒸汽有饱和蒸汽、湿饱和蒸汽和过热蒸汽三种。饱和蒸汽的潜热大、穿透力强、灭菌效果好。湿饱和蒸汽热含量较低、穿透力差，灭菌效果不好。过热蒸汽温度高，但穿透力差，因此灭菌效果也不好。③微生物的种类、发育阶段和数量：微生物的种类和发育阶段不同，其耐热性能存在很大的差异，如芽孢的耐热压性比其繁殖体和衰老体都大得多。④各类制剂的介质性质：制剂中的各类营养物质，如糖类、蛋白质的含量越高，微生物耐热性越强。介质的pH对细菌的生存能力也会有影响，微生物在中性环境中的耐热性最强，在碱性环境中次之，在酸性环境中最不利于微生物的生长。

（二）射线灭菌法

射线灭菌法系指采用辐射、微波和紫外线杀灭微生物和芽孢的方法。根据射线源的不同可分为辐射灭菌法、微波灭菌法和紫外线灭菌法。

1.辐射灭菌法

辐射灭菌法系指采用放射性同位素（60Co或137Cs）发出的γ射线杀灭微生物和芽孢的方法。辐射可以使分子直接发生电离，产生影响微生物正常代谢的自由基，导致生物大分子物质分解，从而杀灭微生物。其特点是：不升高灭菌产品的温度，穿透力强，适用于不耐热药物的灭菌，灭菌效率高；但设备费用较高，对操作人员存在潜在的危险性，须注意安全防护；可能会使一些药物的药效降低，不适于蛋白质、多肽、核酸等生物大分子药物的灭菌，还有可能产生毒性和发热物质等。我国已将60Co辐射应用于药品灭菌中，但目前仅作为中药灭菌的辅助手段。辐射灭菌在应用于药品或食品前都要经过安全测试，以保证灭菌时吸收的辐射量在安全范围之内。

2.微波灭菌法

微波灭菌法系指利用微波照射产生的热能和电场杀灭微生物和芽孢的方法。微波是一种高频电磁波，频率为300MHz～300GHz。其灭菌的作用机制包括热效应和强电场破坏作用，微生物中的水分子吸收微波中的能量并且随着微波电场方向的变化高速转动，分子之间相互摩擦，被灭菌物品温度迅速升高；此外，微波产生的强电场可以破坏微生物的活性结构，最终导致微生物的死亡。

该法适用于液体制剂、中药饮片和固体物料的灭菌，且对固体物料具有干燥作用。其特点是：微波能穿透到介质和物料的深部，可使介质和物料表里均匀地加热；具有高效、快速、能耗低、无污染、易操作、易维护等特点。

3.紫外线灭菌法

紫外线灭菌法系指用紫外线照射杀灭微生物和芽孢的方法。用于灭菌的紫外线波长一般为200～300nm，灭菌力最强的波长为254nm。紫外线能使核酸蛋白变性，还能使空气中的氧气产生微量臭氧，产生协同杀菌作用。该法适用于物品表面的灭菌、无菌室空气及蒸馏水的灭菌等，不适于药液的灭菌及固体物料深部的灭菌。此外，紫外线穿透能力弱，并能被普通玻璃吸收，装于玻璃容器中的药物也不能用紫外线灭菌。

（三）滤过除菌法

滤过除菌法系指基于细菌不能通过致密具孔滤材的原理除去制剂中细菌的方法。繁殖型细菌大小一般>1μm，芽孢≤0.5μm，除菌过滤器的孔径一般小于0.22μm，滤过除菌法的优点是可以保证药物的稳定性，但是滤过除菌并不可靠（不适用于芽孢），一般仅适用于对热相当不稳定的药品溶液、气体的灭菌。

除菌用的过滤介质应能有效地除去物料中的细菌，滤材与滤液不发生相互交换，滤器易清洗，有较高的滤过效率。滤过除菌法的实施需要严格控制其洁净度，应在无菌环境中进行过滤操作。常用的除菌滤器有垂熔玻璃漏斗、微孔薄膜滤器和砂滤棒过滤器等。垂熔玻璃漏斗可耐高温及强酸，其型号以G表示，大体上分为1～6号，G6号可用于滤过细菌。

四、化学灭菌法

化学灭菌法系指用化学药品直接作用于微生物而将其杀死的方法，包括气体灭菌法和液体灭菌法。杀菌剂仅对繁殖体有效，不能杀死芽孢。化学灭菌的目的在于减少微生物的数量，控制无菌水平。理想的杀菌剂应易溶于水、毒性低、作用迅速、杀菌谱广、性质稳定、有效杀菌浓度低。杀菌剂的杀灭效果主要取决于微生物的种类与数量、物体表面的光洁度或多孔性以及杀菌剂的性质等。

1.气体灭菌法

气体灭菌法系指采用气态杀菌剂进行灭菌的方法。气体灭菌法适用于空气和环境的消毒，适用于不耐热的药品、医用器具、设备和设施等的消毒。用于药物灭菌的气体应具备以下要求：在室温下能形成气体或蒸气；穿透力强；毒性低，低浓度就具有杀菌作用；无腐蚀性、爆炸性和刺激性。常用的气态杀菌剂有环氧乙烷、甲醛、臭氧等，环氧乙烷的扩散和穿透能力强，但是易燃易爆，可产生吸入毒性，因此使用时应该要注意；甲醛的杀菌力更强，但穿透力稍差，并且会产生二次污染；臭氧扩散性较高，杀菌能力强，是公认的绿色灭菌剂。

2.液体灭菌法

液体灭菌法系指通过液态杀菌剂溶液进行灭菌的方法。常用的液态杀菌剂有75%乙醇、1%聚维酮碘溶液、0.1%～0.2%新洁尔灭溶液（苯扎溴铵）、2%左右苯酚或煤酚皂溶液等。该法常作为其他灭菌法的辅助措施，适用于皮肤、无菌器具和设备、洁净区环境等的表面消毒。

五、无菌操作

无菌操作系指整个操作过程在无菌环境中制备无菌制剂的方法和技术，主要包括无菌分装和无菌冻干技术。在无菌冻干的生产工艺中，必须采取滤过除菌法来去除微生物。采用无菌生产工艺时，应对生产环境进行监控，以保证在生产工艺过程中对洁净度的要求，此外，还需严格监控无菌操作过程，包括对操作人员的卫生要求，对设备、容器、包装材料、胶塞等进行灭菌，并且保证灭菌之后不会发生二次污染，还须定期对无菌生产工艺进行检验，包括对环境空气过滤系统的有效性验证及培养基模拟灌装试验等。

在药物制剂中，采用无菌生产工艺制备的剂型有注射液、眼用溶液剂或眼用软膏剂等。按此种方法制备出的制剂，最后一般不再灭菌，但必须按照《中国药典》规定的“无菌检查法”进行微生物检验，检验合格后方能使用。

（一）无菌操作室的灭菌

在进行无菌生产之前，需采用适宜的方法对制备的用具、材料以及环境进行灭菌。为使无菌保证水平符合要求，多采用灭菌和除菌相结合的方式。对于流动和静止环境的空气一般采用不同的灭菌方式，前者采用滤过除菌法，而后者采用气体灭菌法。

除应定期对无菌室的空间进行彻底灭菌之外，还要对室内的一切物体、器材、地面、墙壁等进行灭菌，可以用75%乙醇等液态杀菌剂进行喷洒或擦拭。其他用具尽量用热压灭菌法或干热灭菌法灭菌。每天工作前，须在无菌室无人的状态下开启紫外线灯照射1h，中午休息也要开0.5～1h，以保证在无菌状态下进行生产。

（二）无菌操作注意事项

①在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。

②执行无菌操作前，先戴帽子、口罩，洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。

③夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。

④进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂均不可直接接触无菌药品或超过无菌区取物。

⑤无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌物与非无菌物应分别放置。无菌包一打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。

⑥无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的橱柜内，并保持清洁干燥，与非无菌包分开放置，并经常检查无菌包或容器是否过期，其中用物是否过量。