第二节　有效成分的研究与开发

天然药物或中药在创新药物研究开发中扮演着越来越重要的角色。从天然药物中分离得到活性化合物或具有潜在活性的化合物是利用天然药物或中药开发新药的立足之本，没有新结构、强活性的化合物，创新新药的研发就成了空中楼阁。中药有数千年的用药历史，有着丰富的临床基础，对某些疾病具有独特的疗效，且其所含化合物结构新颖，从中寻找活性先导化合物相对容易；但植物中化合物种类繁多，性质各异，有些含量甚少，所以在天然药物生物活性成分的研究过程中，必须利用先进的提取分离方法，结合合理的现代评价手段才能得到较好的效果。

一、活性天然产物的研究与开发

1.活性天然产物的研究模式

早期传统的天然药物研究模式一般是：药材→提取→分离→纯化→天然产物→药理实验→活性化合物，其缺点是盲目性大、花费多、工作量大、筛选中标率低，而且易漏筛一些微量的或难以纯化得到的化合物。在根据医学典籍记载、民间用药经验、临床观察或文献调查选定准备研发的中药或复方后，从创新药物研发的角度出发，应采用活性追踪方法从以下几个方面着手研究。

（1）确定合理的活性评价体系，对将要研究的药物进行药效评价并再次确认其开发价值。一些民间用药可能存在药效评价不确切或片面等情况，需要用现代药效学评价方法进行确认。常用的药理活性实验方法有在体实验和离体实验，由于天然药物一般成分复杂，且有些天然成分本身无活性而经体内代谢后得到的代谢产物才具有较强活性，因此在开发前对药材进行活性确认时最好采用在体实验方法。

（2）根据药材中化学成分的性质将其粗分成几个部分，常用的方法是利用药材化学成分极性大小不同进行粗分，如水煎、醇沉，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等萃取，按等剂量不等强度的原则对每部分进行活性测试，确定活性部位。如果每部分均有活性，但活性均不强，则说明粗分失败，需要改用其他方法重新进行粗分，例如利用化合物种类如生物碱（用阳离子树脂富集）、黄酮（可用聚酰胺树脂富集）等进行粗分，直到找到其中某一部分或几部分活性强、剩余部分无活性或活性很弱为止。

（3）采用现代色谱分离方法对活性部位进行分离，每次分离所得组分均需经活性测试，由于所得量均较少，可采用体外的方法进行活性测试；原则上对于无效的组分常弃去不再研究，但如果分离得到的所有成分体外活性实验均无活性或活性很弱，就应考虑把所有成分（包括离体实验的无效成分）进行在体实验，直至追踪到活性成分。经分离纯化得到一个或多个化合物后，利用现代光谱技术或化学方法确定各个单体的化学结构，并对各个化合物进行活性评价，确定活性化合物。

（4）对具有潜在开发价值的化合物（候选化合物）进行体内代谢研究，了解其ADMET等成药性特征，这对于新药研发相当重要。研究表明：只有10%的候选药物进入市场，被淘汰的候选药物中有大约40%是因药物生物转化或代谢原因而被淘汰，具体表现在以下方面：①吸收不良导致新药开发失败；②肠内菌对药物结构的生物转化导致药物失效；③肝脏药物代谢对药物结构的修饰导致药物失效；④不良的药代动力学参数，如半衰期太短等导致开发失败；⑤生物转化或代谢产物产生毒性；⑥药物代谢基因多态性导致药物效果的个体偏差和应用受限。

（5）根据药物代谢等信息，对候选化合物进行结构修饰和构效关系的研究，进而将其开发成创新药物。

2.天然药物活性成分研究实例

实例一　大黄泻下活性成分的研究

大黄是蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatum）、唐古特大黄（Rheum tangutium）或药用大黄（Rheum officinale）的干燥根及其根茎，具有泻下通肠、凉血解毒、逐瘀通经之功效。生大黄在临床上用于术前清肠和治疗便秘有很好的效果。

为了研究生大黄的泻下活性成分，利用活性追踪方法，首先对大黄化学成分进行粗分，利用化合物极性不同依次用正己烷、氯仿、丙酮、乙醇、水提取，得到成分不同的提取物（图5-2）。

对各部位进行活性检测，各提取物以大白鼠口服观察其致泻作用作为活性追踪指标。活性测试显示正己烷、氯仿和丙酮提取物基本上无泻下作用；乙醇提取物有较弱泻下作用；水提取物泻下作用最强，给药剂量为200mg/kg时对10只大白鼠全都具有泻下作用，故其主要活性部位应为水提取物。

对有效部位进行成分分离：取水提取物70g，加水1000mL，研磨均匀后通过阳离子交换树脂除去离子成分，流出液用正丁醇提取，正丁醇提取物加入乙醇溶解，乙醇不溶物用丙酮重结晶，得番泻苷A 2.4g（图5-3），各部分分别进行活性测试，结果见表5-1。由表5-1可知水溶物无效，乙醇可溶物虽然略有效，但不是主要有效成分，乙醇不溶物才是它的有效部位或组分，番泻苷A的作用较乙醇不溶物强，推断它应是大黄泻下的有效成分。此外，通过色谱方法从乙醇不溶物中还检出番泻苷B和C，可能也是其泻下的有效成分。

实例二　茜草根中抗肿瘤活性成分研究

茜草根为茜草科植物茜草（Rubia cordifolia）的根，1982年日本学者系川秀治等采用小鼠腹水型S180癌细胞，筛选64种生药醇提取物的抗癌作用，发现其具有抗癌作用。其后在对茜草化学成分研究中，发现存在于茜草中的多种蒽醌类色素都没有抗癌作用，根据生物活性指导分离方法，以P-388白血病小鼠作抗癌实验，对茜草根中抗肿瘤活性成分进行追踪分离，从中分离得到了具有抗肿瘤活性的RA-Ⅴ、RA-Ⅶ等环肽类化合物（图5-4）。

按等剂量不等强度进行活性测试，甲醇、苯、乙酸乙酯及水提取物按200mg/kg剂量给药，其余则按200×（Y/100）mg/kg剂量给药（Y为苯提取物为100时各组分的收率，故实际上各组分的剂量与苯提取物剂量相当，测得的活性有定量的比较意义），给药方式为腹腔注射，每日一次，连续五次。

抗癌效果以给药组平均存活天数（T）相对于对照组动物平均存活天数（C）的百分率表示，T/C＞125%时认为有效。其活性追踪分离过程如图5-4所示。

在得到化合物RA-Ⅴ、RA-Ⅶ后，进一步实验发现二者都具有较好的抗肿瘤活性，其中RA-Ⅶ对P-388白血病小鼠有效剂量达0.01mg/kg（T/C：130.1）。它们在药材中含量都很低，只有近万分之一，1987年完成了它们的合成，但还没有生产价值。目前RA-Ⅶ在日本已进入Ⅰ期临床。

二、活性天然产物的化学合成与结构修饰

1.活性天然产物的化学合成与结构修饰概述

活性天然产物直接用作药物往往存在较大缺陷，如有的化合物在天然药物或中药中含量极低，原料药来源难以保障，典型的例子如紫杉醇；有的活性低，或者抗菌谱窄、耐药性强、稳定性差；有的副作用大等。目前我国天然药物化学研究的目的之一就是获得高效低毒的创新药物，这就需要以活性天然产物为先导物，采用相应技术进行化学合成和结构修饰，对所得的衍生物进行定量构效关系比较，寻找到理想的活性化合物，并将其开发成创新药物。

天然产物结构改造的目标是将其开发成新药。药理活性和成药性的所有内容都是结构改造的要点。要根据天然产物的结构、活性、物化性质、药代性质的不足或缺陷针对性地改造。一般遵循如下原则：提高活性强度，提高选择性作用；改善溶解性、分配性和离解性等物理化学性质；提高化学和代谢稳定性；改善生物化学性质；改善吸收、分布、代谢、排泄的药代动力学性质；消除或降低毒副作用和不良反应；具有结构新颖性，获得知识产权保护。

2.活性天然产物化学合成与结构修饰实例

实例三　青蒿素的结构修饰

青蒿素（artemisinin）是由菊科植物青蒿（Artemisia annua L.）全草中分离得到的一种抗疟疾活性成分，但其生物利用度低，口服后大部分以原型排出，因此需对其进行结构改造（图5-5）。经过一系列衍生化合成了3种类型的化合物：醚类、酯类和碳酸酯类，共300多个衍生物，经活性比较发现其中有多个化合物的活性比青蒿素高出10～30倍，在经过一系列药效、毒性及临床研究综合评价后，化合物甲基化还原青蒿素（蒿甲醚，artemether）的抗恶性疟疾疗效是青蒿素的14倍，已开发成一类新药上市。

实例四　鬼臼毒素的结构修饰

鬼臼毒素（podophyllotoxin）最早得自盾叶鬼臼（P.peltatum），后从P.pleianthum、桃儿七（Sinopodophyllum emodi）和山荷叶（Diphylleia grayi）等近缘植物中也提取得到过，具有显著的抗肿瘤和抗病毒活性，但由于毒性强，副作用大而使其使用受到限制。通过结构改造后，所得的衍生物依托泊苷（etoposide，VP-16）及其磷酸盐（etoposide phosphate，etopophos）和替尼泊苷（teniposide，VM-26）已成为临床应用于抗癌的代表药物。

临床发现，上述药物对小细胞肺癌、睾丸癌、急性白血病以及恶性淋巴肿瘤等多种癌症均有良好的疗效。但也存在诸如抗瘤谱较窄、水溶性较差以及较严重的骨髓抑制与胃肠道反应等缺点，从而限制了其应用。为进一步寻找效果更好、毒性更低的抗肿瘤新药，近年来通过对鬼臼毒素衍生物结构改造和构效关系的研究合成了很多活性化合物。VP-16和VM-26经结构修饰，其衍生物GP-11、NK-611、TOP-53、NPF作为抗肿瘤药已进入临床Ⅱ、Ⅲ期。

实例五　根皮苷的结构修饰

根皮苷是由根皮素和葡萄糖结合而成的苷，属于二氢查耳酮类化合物，主要存在于苹果的根皮、茎、嫩叶和果实中。根皮苷能够抑制肾小管的钠-葡萄糖协同转运蛋白-2（SGLT-2），使葡萄糖从尿液排出，从而降低血糖水平。然而根皮苷也抑制小肠黏膜的钠-葡萄糖协同转运蛋白-1（SGLT-1），这是导致其副作用和不能成药的原因之一，因此以根皮苷为先导化合物进行了一系列结构改造（图5-6）。结构改造的目的是：①消除对SGLT-1抑制作用，提高对SGLT-2的选择性抑制；②去除或减少酚羟基以降低Ⅱ相代谢，延长体内存留时间；③提高化合物苷键的体内稳定性。

活性测试结果显示，T-1095（前药）的选择性增加，但糖苷键稳定性较差；舍格列净（sergliflozin）减少了两个芳环之间的原子，依然对SGLT-2有选择性，提示结构骨架可以发生较大的改变，但由于稳定性问题未能成药；为提高苷键的稳定性，将舍格列净的O-苷变成C-苷，并在苯环上进行一系列结构修饰，最终发现稳定性和选择性都很强的达格列净（dapagliflozin），于2012年经欧盟批准上市，成为首个以SGLT-2为靶点的Ⅱ型糖尿病治疗药物；对芳香环用杂环进行替换，经过筛选得到坎格列净（canagliflozin），并于2013年经美国FDA批准上市；随后又开发了依格列净（ipragliflozin）和托格列净（tofogliflozin），目前均处于Ⅲ期临床试验阶段。

实例六　埃博霉素的结构修饰

埃博霉素（epothilones，埃坡西龙）是由黏细菌纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）产生的次级代谢产物，是一类以16元内酯大环为中心体，噻唑环配基为侧链的细胞毒性化合物，主要包括epothilone A和epothilone B。埃博霉素对肿瘤细胞有抑制活性，其作用机制与紫杉醇相似——抑制微管解聚，即抑制外周血液中单核细胞的αβ-Ⅱ型和αβ-Ⅲ型微管蛋白的动态不稳定性，促使游离的微管蛋白亚基装配成微管并结合到微管上，从而抑制微管的解聚，使已形成的微管稳定，纺锤体无法生成，因而使细胞分裂停止在有丝分裂中期，导致肿瘤细胞凋亡。此外，埃博霉素还能抑制p-糖蛋白（p-gp）介导的在紫杉醇结合区域的突变引起的多药耐药（MDR）和MRP-1的过度表达以及紫杉醇耐药的乳腺癌患者β-Ⅲ型微管蛋白过表达。

与紫杉醇相比，埃博霉素的水溶性好，毒副作用小，结构较为简单。埃博霉素的母核可进行多位点的修饰，对埃博霉素的修饰包括16元环骨架上杂原子的引入及环大小的改变，双键的增减和顺反异构等，这些修饰都使大环骨架发生了改变，骨架的改变能够显著地改变埃博霉素的空间结构，从而明显影响其生物活性。经过近十多年的努力，目前已产生了上百种埃博霉素类似物和衍生物，表现出不同的微管蛋白聚合活性和抗增殖活性，且有部分衍生物已经上市或进入临床试验阶段。

Ixabepilone已经于2007年经美国FDA批准上市，是迄今第一个上市的埃博霉素衍生物，被认为是21世纪疗效最高的抗肿瘤药物。另外，epothilone B目前处于Ⅲ期临床试验阶段，sagopilone、epothilone D和9，10-dedihydro epothilone D处于Ⅱ期临床阶段，而21-amino epothilone B和26-fluoro epothilone B处于Ⅰ期临床试验阶段。

三、活性天然产物研究需要注意的几个问题

（1）创制新药，基础研究是关键

如果没有长期深入、扎实和雄厚的基础研究工作积累，就不会有创新药物的发展，新药的来源也很快就会枯竭。我国新药研究与国际先进水平仍有很大差距。多年来创制的新药品种少，有特色的药物更少。其根本原因是基础研究薄弱，不能满足创新药发展的需要。

新药研究艰难，短期内难以取得明显成效，因此一部分科研人员不愿从事探索性强、需要长期进行的基础研究，而选择一些短线课题和开发研究项目。很多天然药物化学研究停留在新结构化合物的发现、跟踪性研究或缺乏创新的开发阶段。虽然研究“短、平、快”和“me too”类新药可解燃眉之需，但从长远考虑，加强基础研究、储备技术和人才、发展具有我国自主知识产权的新药才是根本目标。

天然药物化学研究的深入应以定量构效关系和三维构效关系理论为指导，在先导化合物分子结构的优化方面下功夫，即根据疾病的病因、发病机制、细胞生物学特点、受体的结构等寻找活性尤其是有特殊作用机制的先导化合物，利用适当的药理模型研究分子的活性和毒性作用机制，在此基础上进行分子的结构改造，研究分析不同活性的分子其结构和构象的差异，总结其活性所必需的结构及其与某种药理（毒理）作用之间的规律，据此进行结构优化，为设计合成高效低毒的新药奠定基础。在此过程中，不仅要充分应用还要不断地总结和发展构效关系的理论。

基础科学研究的根本在于创新，科学研究的积累可以开拓创新的思路。目前我国天然药物化学研究的思路大多是跟踪国际热点，缺乏原始的创新思路，探索性不强。如紫杉醇、三尖杉酯碱、长春新碱等抗癌药物，都是在国外有一定研究基础后移植过来的，我国自行发现的类似这样疗效好、作用机制明确、得到国际公认的新药极少。往往是有个好的苗头化合物大家便纷纷一拥而上，将许多人力、物力集中在某个热点的跟踪研究上，不利于该领域的发展，也难以发展成为具有我国专利的创新药物。

（2）一些研究者只是单纯进行化学研究，满足于发现一些新化合物以发表文章，对活性研究不够重视。

为了能够发现新的化合物或新的结构，一些研究者对有多年临床经验积累的中药或民间药兴趣不大，宁可去研究寻找新的植物资源，而不管它是否有活性或是否有临床经验。而有的活性成分研究的思路和方法不当，所谓“活性成分研究”，多半只是将分离得到的化合物在测定结构之后，再送至有关活性筛选部门进行活性筛选，收效甚微。较少有人采用活性导向分离（bioactivity-guided isolation）方法，因此那些含量甚微又难于分离的活性成分在分离过程中可能丢失，且丢失了也难于察觉。

（3）创新药物的开发是一个高技术、高风险、高回报、知识密集型的系统工程，涉及化学、药理、制剂、临床药学、毒理学等多学科领域，研发过程需要多学科相互配合、联合攻关。

我国现有的研发项目，多不是以一个有机的研究整体进行的，许多单位是以委托研究的方式，分成若干部分，分别委托不同的研究单位完成。比如化学家与生物学家相互脱节，生物学家尽管不断宣布在身体机能、细胞或基因调控方面的新发现，但未能投入实际应用，未能在此基础上建立起新的灵敏、简便、可靠的活性筛选体系，故化学家即使想进行活性成分研究，也常常无法进行。因此，学科之间缺乏信息沟通，导致某些涉及多学科的问题无法得到有效解决。如用于心脑血管治疗的药物，药代结果表明在心脑中无分布，对此结果如果不与药效学研究密切合作，就拿不出合理的分析结果；另外如药代动力学研究常忽视对药物靶器官的药物分布检测；对水溶性低或不溶于水、生物利用度很低的口服药物也不进行深入研究和寻找解决方法等，这些对中药新药的综合评价均造成较大影响。

（4）建立特异性强、灵敏度高、靶点明确的体内外筛选模型是源于天然产物的新药先导化合物发现的重要环节。

一个药物在整体动物实验中有效，而在体外实验中则效果明显下降，除了前面提及的该药物可能是前体药物外，另一原因可能是由于在体外实验中，在限定的条件和已知的模型上，药物或其单体并非主要影响这一靶点，而是作用在其他靶点上，导致作用效果不强。如有些抗糖尿病药物，体内降糖作用明显，但它们对糖代谢和胰岛素分泌均无影响，而是通过影响肠道内的葡萄糖苷酶来减少葡萄糖的吸收。

常用的活性测试方法有整体动物、动物的器官、组织、酶、受体以及药物对体内某些生物活性物质的抑制或促进等。天然成分的活性筛选采用整体动物进行实验与人更为接近，但所需实验费用很大、现象复杂、时间长，加以动物个体差异以及病理模型难于建立等因素，实际上用其指导活性追踪分离难以做到。最好的方法是寻找活性部位时用整体动物实验，追踪分离成分用体外的方法。理想的体外活性测试方法应具有简易、快速、不需要特殊设备、方便、抗干扰性强、假阳性和假阴性均较低、临床相关性强等优点，但在实际工作中理想的活性测试方法往往很难找到，只有综合分析考虑，根据实际情况、条件以及研究开发的课题选择较理想的活性测试方法。同时也要根据实践经验积累和科学技术的发展，改进现有的一些活性测试方法，在生命科学研究基础上，建立起新的、可以简便用于指导目标活性物质分离追踪的生物活性筛选体系。

（5）确保供试材料具有活性是能够追踪到活性化合物的前提。

在活性追踪分离之前一定要采用体内体外多种方法、多个指标对实验材料进行活性测试，其目的为：①再次确证实验材料的活性，确定有无进行下一步研究的价值；②为选择活性追踪分离所用的活性测试方法提供依据。图5-7所示的流程是美国癌症研究中心（NCI）用于筛选确认植物或动物粗提物抗肿瘤活性的改进方案，通过该方案确认的实验材料至少有以下三个优点：①不至于丢失活性低或含量少的化合物；②增加了分离出新化合物的机会；③有可能分离到具有不同作用机理或新的作用机理的化合物。

由于植物原材料中所含的化学成分及活性成分与产地、采收季节、气候、品种及放置时间等有关，为了保证所用实验材料质量的稳定性，在正式开始活性追踪分离之前，最好要一次采集或购买到所需实验材料，并经简易的方法再次确认活性并一次提取完毕，将提取物置于冰箱中保存。