第一节　结构研究的一般程序

一、化合物纯度的判定

化合物纯度的判定是结构研究的基础。化合物混有杂质，纯度不够，会大大增加结构鉴定的难度或产生错误结论。因此结构研究的第一步就是要确定化合物的纯度。判定纯度的方法主要有以下两种。

1.根据化合物的理化性质和常数判定

固体物质根据有无一致的晶形和均匀的色泽、有无明确的熔点和较窄的熔距进行判定；液体物质根据有无恒定的沸点、沸程、折射率及相对密度等判定。若是已知物，则只要将其比旋度与文献数据对比，如相同则表明其已是或接近纯品。

2.根据化合物的色谱行为判定

这是最常用的方法。目前结构鉴定中采用的色谱方法包括薄层色谱（TLC）、纸色谱（PC）、气相色谱（GC）和高效液相色谱（HPLC）等。需要注意的是，无论采用何种色谱法检查，一般需用多种差别较大的溶剂系统或色谱条件进行检测，均显示单一的斑点或色谱峰时方可认为是单一化合物。必要时可以把正相和反相色谱方式相结合，从多角度确保准确性。

二、理化常数的测定

天然化合物结构研究中常测定的理化常数有：熔点（固体纯物质熔距范围为0.5～1.0℃）、沸点（除高沸点物质外，液体纯物质沸程≤5℃）、比旋度、折射率、相对密度、pH、不同溶剂中溶解度、灼烧试验和化学定性反应等。这些理化常数能为化合物的种类和结构的推测提供必要的线索。

三、分子式的确定与不饱和度的计算

1.测定分子式

分子式的测定方法主要有3种，即元素定量分析配合分子量测定法、同位素丰度比法和高分辨质谱法。但随着方便快捷的高分辨质谱仪的普及，前两种确定分子式的方法现已很少使用。

（1）元素定量分析配合分子量测定

元素定量分析前，通常先进行元素定性分析，如采用钠融法等，一般都委托专门的实验室进行。当化合物仅含C、H、N、S、O五种元素时，通常只做前四种元素的定量，O通过扣除法计算。一般几毫克样品即可用元素分析仪分析C、H、N、S、O等元素各自的比例；如果样品量多达几十毫克，还可以测定某些金属元素的占比，如钠等。

其次，测定化合物的分子量。主要测定方法有冰点下降法（固体物质）、沸点上升法（液体物质）、黏度法、凝胶过滤法等，但目前最常用的方法是质谱法。值得强调的是，待测样品纯度必须足够，否则测定结果没有意义。这里以青蒿素为例，分析过程如下：

① 元素定量分析

元素定量分析得到下列结果：

C：63.72%；H：7.86%

从100%中扣除C、H后，得：

O=100%-63.72%-7.86%=28.42%

分别以各元素的百分含量除以各元素的原子量，即可求出三种元素在结构中所占的比例，继以各数除以其中数值最小的一项，即得三种原子比。

按倍比定律，原子间的化合一定是整数，若上述原子比约简化为C3H4O，则该实验式的各元素百分含量与实测值差异较大；若将上述原子比简化为3∶4.4∶1，则其最小公倍数即C15H22O5，其中各元素百分比与实测值基本一致。数据对比如下：

实验式：C15H22O5

理论值：C，63.81%；H，7.85%；O，28.34%

实测值：C，63.72%；H，7.86%；O，28.42%

显然C15H22O5的理论值与实测值比较相近，故确定该化合物分子式为（C15H22O5）n，n=1，2，3…，确切的分子式则等分子量测定后才能确定。

② 分子量的测定　该化合物由电子轰击质谱（EI-MS）法测得的分子离子峰[M]+为282。

即：（C15H22O5）×n=282，n=282/282=1

故确定青蒿素的分子式为C15H22O5。

（2）同位素丰度比法

天然产物中常见的组成元素（氟、磷、碘除外）均由相对丰度恒定的同位素组成，重元素一般比轻元素重1～2个质量单位。如表4-1所示。

故由重元素组成的分子比轻元素组成的分子一般要重1～2个质量单位。因此在观察具有稳定分子离子峰的MS图谱时，可在比分子离子峰[M]+多1～2个质荷比（m/z）的地方同时见到[M+1]+和[M+2]+两个同位素峰。特定化合物具有相对强度固定的[M]+、[M+1]+及[M+2]+峰（含Cl、Br时除外）。这就是为什么同位素丰度比法能够求算分子式的原因。

同位素丰度比法试样用量少，对Mr＜500且能生成稳定分子离子的化合物而言，值得优先使用。

（3）高分辨质谱法（high resolution mass spectrometry，HR-MS）

高分辨质谱法通过测定化合物的精确分子量然后直接由计算机计算出分子式。以12C=12.0000为基准，1H、14N、16O等各元素原子的精确质量分别是1.007825、14.00307、15.99491。由于HR-MS可将化合物的质量精确到小数点后三位，故分子量相近的化合物可根据HR-MS得到的精确质量进行区分。表4-2中所列C15H22O5、C15H24NO4、C14H20NO5、C14H22N2O4四个化合物，由于其精确质量不同，则通过HR-MS可区分出来。

2.不饱和度的计算

不饱和度的计算公式为：

u=Ⅳ-Ⅰ/2+Ⅲ/2+1

u表示不饱和度；Ⅰ为一价原子（如H，D，X）的数目；Ⅲ为三价原子（如N，P）的数目；Ⅳ为四价原子（如C，S）的数目。二价原子（如O，S）与不饱和度无关。

以C15H22O5化合物为例，不饱和度为：

u=15-22/2+0/2+1=5

四、化合物的功能团和分子骨架的推定

在一个化合物的分子式确定后，就需要进行分子结构骨架和官能团的确定。一般而言，首先根据化合物的不饱和度，推算出结构中可能含有的双键数或环数，然后利用样品与某种试剂发生颜色变化或产生沉淀等化学定性实验对化合物类型进行初步判断。显色反应时最好将未知样品试验、空白试验及典型样品试验平行进行，以资对照。当根据产生沉淀判断结果时，要注意液体试样量如过多，会使沉淀现象不明显或沉淀溶解，掩蔽阳性结果；样品分子中含有两种以上官能团时，可能干扰检识反应。因此，根据一种检识反应的结果尚不足以肯定或否定该官能团的存在，最好做两种以上试验，以求得正确的判断。最后将化学定性实验结果与所测得的物理常数、波谱数据（UV，IR，NMR，MS等）结合起来综合分析，以确定化合物含哪些功能团，具有何种母核，属于哪类化合物。当然，现在测定化合物的波谱数据已经非常方便快捷，故化学定性实验和理化常数测定可根据需要有选择地测定。

五、化合物结构的确定

对于已知化合物，若有对照品，则用对照品同时进行熔点、混合熔点、色谱和红外光谱对照。若无对照品，则需测试更多数据，或制备衍生物并核对文献以确定结构。对于未知化合物，应测定该化合物或其衍生物的波谱数据，并进行化学沟通以确定结构。

由于同科属生物容易代谢相似或相同的化合物，故在解析化合物的结构之前，应对同科属的生物代谢产物的文献进行调查，并从其中获得相应的理化性质和波谱数据。通过与这些已知化合物的数据比对，有助于对待定化合物进行结构解析。另外，随着计算机网络和信息处理技术的快速发展，商业化的核磁共振谱数据库已经可以提供给用户快速的数据比对和相似度查询，这大大提高了谱图解析的速度。当然，化合物的具体结构还必须通过对谱图进行完整的解析和归属，才能最终确定。

总之，确定一个天然化合物的分子结构，是一项较复杂的工作，涉及面广，很难说有一个固定的、一成不变的研究程序。每个环节的应用方法均各有侧重，且因每个人的经验、习惯及对各种方法熟练掌握、运用的程度而异。一个化合物的结构研究往往是综合化学工作、仪器分析、植物化学分类学及文献检索等工作而获得的结果。