第四节　蛋白质的性质与分离纯化

蛋白质是氨基酸的多聚体，因此它所具有的很多性质是由组成它的氨基酸残基带来的，例如紫外吸收、两性解离和等电点。但作为生物大分子的蛋白质又由于其特有的共价结构与三维结构的影响，具有许多特有的性质，例如变性、复性和水解等。利用蛋白质的特有性质和不同蛋白质某些性质上的差异而对蛋白质进行分离纯化。

一、蛋白质的性质

（一）蛋白质的两性性质

蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，即能和酸作用，也能和碱作用。蛋白质分子中可解离的基团除肽链末端的α-氨基和α-羧基外，主要还是多肽链中氨基酸残基上的侧链基团，如ε-氨基、β-羧基、γ-羧基、咪唑基、胍基、苯酚基、巯基等。在一定的pH条件下，这些基团能解离为带电基团，从而使蛋白质带有电荷。常见氨基酸侧链的解离见表1-8。

当某蛋白质在一定的pH溶液中，所带的正负电荷相等，它在电场中既不向阳极移动也不向阴极移动，此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点pI。由于一个蛋白质分子含有多个氨基酸残基，其解离情况要比单个氨基酸或一个小肽复杂得多，因此一种蛋白质的pI不能直接计算，只能使用等电聚焦等方法测定。由于各种蛋白质的等电点不同，在同一pH时所带电荷不同，在电场作用下移动的方向和速度也不同，所以可用电泳来分离提纯蛋白质。蛋白质的两性解离如图1-38所示。

（二）蛋白质的紫外吸收性质

Trp、Tyr和Phe三种芳香族氨基酸的R基团在280nm波长附近有最大的吸收峰，由于绝大多数蛋白质都具有这三种氨基酸，所以蛋白质也会有紫外吸收现象，最大吸收峰在280nm。尽管核酸也有紫外吸收，但其最大吸收峰在260nm。因此，测定蛋白质溶液在280nm的光吸收值已成为测定溶液中蛋白质含量的最便捷的方法。

（三）蛋白质胶体性质

蛋白质的分子量在10000～100万，其分子直径1～100nm，是胶体颗粒的范围。蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为在其表面分布很多极性基团（—NH2、—COOH、—OH、—SH、—CO、—NH等），亲水性强，易吸附水，形成水化膜（水化层），使蛋白质溶于水，又可隔离蛋白质，使其不易沉淀；又因为在非等电状态时，都带有相同的净电荷，互相排斥而不易沉淀，并与周围的相反离子构成稳定的双电层，所以蛋白质具有胶体性质，如布朗运动、光散射、电泳、不能透过半透膜及具有吸附能力等。利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等来分离纯化蛋白质，此方法称透析（dialysis）。

蛋白质的胶体性质具有重要的生理意义。在生物体内，蛋白质与水结合构成各种流动性不同的胶体系统。实际上，细胞的原生质就是一种复杂的胶体系统，体内许多的代谢反应即在此系统中进行。

（四）沉淀反应

蛋白质在溶液中靠水化膜和双电层保持其稳定性，水化膜和双电层一旦失去，蛋白质胶体溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中絮结沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。根据沉淀后是否能重新溶解成溶液分为可逆沉淀和不可逆沉淀。

1.可逆沉淀

在温和条件下，改变溶液的pH或电荷状况或除去水化层，蛋白质将从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，又可重新溶解形成溶液的沉淀叫做可逆沉淀，又称为非变性沉淀。

可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法。主要包括以下几种。

（1）等电点沉淀法　在蛋白质溶液中加酸使其达到蛋白质的等电点（一般蛋白质的等电点皆偏酸性），破坏蛋白质表面电荷的排斥作用，蛋白质溶解度降低而沉淀。

（2）盐析法　在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐可使蛋白质溶解度降低并沉淀析出的现象叫盐析。盐在水中迅速解离后，与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质颗粒表面的水化膜；另外，离子可大量中和蛋白质表面上的电荷，使蛋白质成为既不含水化膜又不带电荷的颗粒而聚集沉淀。硫酸铵是最常用的中性盐。

（3）有机溶剂沉淀法　某些与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮）等可使蛋白质产生沉淀，这是由于有机溶剂的亲和力比水大，能破坏蛋白质表面的水化膜，从而使蛋白质的溶解度降低并产生沉淀。

2.不可逆沉淀

不可逆沉淀是在强烈沉淀条件下，破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性及蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水，又称为变性沉淀。主要有以下几种。

（1）加热沉淀　几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类能促进蛋白质加热变性。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性使蛋白质天然构象解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时也破坏了带电状态。

（2）强酸碱沉淀　由于破坏了氢键而造成不可逆沉淀。

（3）重金属盐沉淀　当pH大于pI时，蛋白质颗粒带负电荷，这样它容易与重金属离子（Hg2+、Ag+、Pb+等）结成不溶性盐而沉淀。

（4）生物碱试剂及某些酸类沉淀法　当溶液pH小于pI时，蛋白质颗粒带正电荷，与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。常见的生物碱试剂有单宁酸、苦味酸、钨酸、三氯乙酸、磺基水杨酸。

（五）蛋白质变性与复性

蛋白质受到某些理化因素的影响，使其空间构象发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变，这种现象叫变性（denaturation）。变性后的蛋白质称为变性蛋白质。二硫键的改变引起的失活可看作变性。

影响蛋白质变性的原因很多，主要是受温度、pH、有机溶剂和别构激活剂等影响。

（1）温度　多数酶在60℃以上开始变性，热变性通常是不可逆的。多数酶在低温下稳定，但有些酶在低温下会钝化，其中有些酶的钝化是不可逆的。如固氮酶的铁蛋白在0～1℃下15h就会失活，一个可能的原因是寡聚蛋白发生解聚，如TMV的丙酮酸羧化酶。

（2）pH　酶一般在pH4～10范围较稳定。当pH超过pK几个单位时，一些蛋白内部基团可能会翻转到表面，造成变性。如血红蛋白中的组氨酸在低pH下会出现在表面。

（3）有机溶剂　有机溶剂能破坏氢键，削弱疏水键，还能降低介电常数，使分子内斥力增加，造成肽链伸展、变性。

（4）胍、尿素等　变性剂胍、尿素等破坏氢键和疏水键而使蛋白质变性。硫氰酸胍比盐酸胍效果好。

（5）某些盐类　盐溶效应强的盐类，如氯化钙、硫氰酸钾等，有变性作用，可能是与蛋白质内部基团或溶剂相互作用的结果。

（6）表面活性剂　如SDS-、CTAB+、triton等。triton因为不带电荷，所以比较温和，经常用来破碎病毒。

蛋白质变性后分子性质改变，黏度升高，溶解度降低，结晶能力丧失，旋光度和红外、紫外光谱均发生变化；变性蛋白质对蛋白酶敏感性增大，易被水解，即消化率上升；变性蛋白质基团位置改变，包埋在分子内部的可反应基团暴露出来，反应性增加；生物活性失去，抗原性也发生改变。

这些变化的原因主要是高级结构的改变，氢键等次级键被破坏，肽链松散，变为无规卷曲。由于其一级结构不变，所以如果变性条件不是过于剧烈，则是一种可逆过程，在适当条件下还可以恢复功能。高级结构松散了的变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠形成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性。如胃蛋白酶加热至80～90℃时，失去活性，降温至37℃，又可恢复活力，这种现象称为复性（renaturation）。但随着变性时间的增加，条件加剧，变性程度也加深，则达到不可逆的变性。

研究蛋白质的变性，可采取某些措施防止变性，如添加明胶、树胶、酶的底物和抑制剂、辅基、金属离子、盐类、缓冲液、糖类等，可抑制变性作用。但有些酶在有底物时会降低热稳定性。有时有机溶剂也可起稳定作用，如猪心苹果酸脱氢酶，在25℃下保温30min，酶活力为50%；加入70%甘油后，经同样处理，活力为100%。

变性现象也可加以利用，如用酒精消毒，就是利用乙醇对蛋白质的变性作用来杀菌。在提纯蛋白质时，可用变性剂除去一些易变性的杂蛋白。工业上将大豆蛋白变性，使它成为纤维状，就是人造肉。

蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于强碱或强酸溶液中，若将pH调至等电点，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶于强酸和强碱中，如再加热则絮状物可变成较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸与强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用。如鸡蛋煮熟后本来流动的蛋清变成了固体。实际上凝固是蛋白质变性后进一步发展的不可逆的结果。

（六）蛋白质的颜色反应

蛋白质的化学性质也和氨基酸一样，游离的α-氨基、α-羧基和R基可以发生与氨基酸中相应基团类似的反应；N端的氨基酸残基也能与茚三酮发生定量反应，生成呈色物质。但蛋白质因为具有特殊结构而具有氨基酸不具有的反应——双缩脲反应。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产物的颜色深浅在540nm处进行蛋白质的定量测定。

（七）蛋白质的水解

酸、碱及蛋白质水解酶皆可破坏蛋白质的肽键使蛋白质经过一系列的中间产物，最后产生氨基酸，这些中间产物中最主要的是蛋白胨。蛋白胨可溶于水，遇热不凝固，不被饱和的硫酸铵溶液所沉淀，常被用作细菌培养基的成分。

二、蛋白质的分离、纯化

蛋白质的分离和纯化不仅有助于研究蛋白质本身的结构与功能，也有助于研究其基因的结构与功能，而且具有工业或医药应用价值的蛋白质也需要得到它们的纯品。例如，如果无法直接得到一种蛋白质的基因，那么通过纯化蛋白质，就可以测出它的一部分的氨基酸序列，然后根据遗传密码表设计和制作核酸探针，去“钓”出它的基因；或者以纯化的蛋白质免疫动物得到抗体，从cDNA表达文库中分离出它的基因。如果已经分离得到一种蛋白质的基因，那么在纯化到这种基因的蛋白质产物以后，可以对其性质、构象及其功能进行全方位的研究。

（一）分离纯化的一般步骤

分离纯化某一种蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级分离、细分级分离和结晶四步。

（1）前处理　制备一个蛋白质样品首先要考虑它是在细胞内还是细胞外，如果在细胞外（如血清、尿等体液）就可以直接进行分离。但实际上大多数蛋白质是在细胞内，就要将细胞破碎，使蛋白质释放出来。细胞破碎的方法很多，破碎动物细胞可用电动捣碎机、匀浆器或超声波破碎法。对植物组织可使用匀浆器或采用石英砂与抽提液混合研磨的方法。微生物细胞的破碎由于细胞壁的存在而比较困难，常用的方法是用溶菌酶（破坏细胞壁的肽聚糖）处理除去细胞壁后再加超声波处理破碎的方法，而工业上常采用微小石英砂混合研磨法、减压法等。如果待制备的蛋白质位于某一个细胞器中，可在破碎细胞后通过差速离心法得到该细胞器，这样就可以除尽细胞质中的蛋白质。如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。

（2）粗分级分离　当蛋白质混合物的提取液获得后，选用一套适当分离纯化方法，使目的蛋白与大量的杂蛋白分离开。一般这一步采用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。

（3）细分级分离　即将样品进一步提纯的过程。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白已经大部分被除去，但还需进一步纯化，以获得单一的蛋白质样品。通常采用色谱法（凝胶过滤色谱、离子交换色谱、吸附色谱、亲和色谱、疏水色谱）、电泳法（自由界面电泳、凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、盘电泳、等电聚焦、双向电泳）、密度梯度离心等。

（4）结晶　结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度的一个标志，也是判断制品是否有活性的指标。蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。当溶液略处于过饱和状态，通过控制温度、加盐盐析、加有机溶剂或调节pH等方法能使蛋白质结晶，接入晶种能加速结晶。

（二）蛋白质分离纯化的方法

分离纯化蛋白质的各种方法都是利用蛋白质的各种理化性质，例如，质量和形状、溶解性、表面电荷、表面吸附性、与特定配体结合性、表面疏水性等。

常用的方法有：沉淀（溶解性）、离子交换（电荷性）、聚焦色谱（电荷性）、凝胶过滤（大小和形状）、疏水作用色谱（疏水性）等。

在纯化过程中，有时候样品体积较大，需要进行浓缩以缩小体积。常用的浓缩法有：沉淀、冻干、对50%甘油透析、对固体聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）透析、超滤等。

下面就蛋白质的性质对一些方法和原理做简单介绍。

1.根据分子大小差异分离蛋白质

（1）透析（dialysis）　利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使它与其他小分子化合物如无机盐、单糖、氨基酸以及表面活性剂等分离的方法。此方法常被用于去除大分子溶液中的小分子物质或改变蛋白质的溶液组成。常用的半透膜有玻璃纸、火棉纸和其他改型的纤维素材料，截止分子量一般为10000。

（2）超滤（ultrafiltration）　对透析原理进行了改进，在一定的压力或离心力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的超滤膜时，小分子量的物质滤过，而大分子量的蛋白质被截留，从而达到脱盐、浓缩或更换缓冲液的目的。

（3）密度梯度（区带）离心　在密度梯度介质中进行的一种沉降速度离心，被离心的物质根据其沉降系数不同进行分离。沉降速度与颗粒的质量、密度和形状有关。质量和密度大的颗粒沉降较快，离心后按沉降的速度不同，彼此分开形成区带（停止于与自身密度相等的介质密度梯度）。常用蔗糖或甘油来制备梯度。密度梯度离心是依赖时间的，如果离心时间过长，已经分离的物质均可沉降到离心管的底部或某一区域。

（4）平衡密度梯度离心　也是在密度梯度中进行的，但被分离的物质是依靠它们的密度不同进行分离的，此种离心常用CsCl等无机盐类制备密度梯度。在梯度介质中，当被分离的物质分别达到与其密度相同的介质部位时就不再移动，从而达到分离的目的。平衡密度梯度离心是不依赖于时间的，只要梯度不破坏，时间延长也不影响分离。

（5）凝胶过滤（gelfiltration）　又称分子排阻或分子筛色谱，即以具有分子筛效应的惰性颗粒状多孔网状物质为支持物，根据分子大小的不同分离物质的技术（图1-39）。较大的分子不能或很难进入多孔凝胶颗粒内部，通过颗粒间隙向下流动，行程短，被先洗脱下来；较小的分子可以进入凝胶颗粒内部，路径迂回曲折，行程长，后洗脱下来。从而达到按不同分子量将溶液中各组分分开的目的。

凝胶过滤介质是凝胶珠（或称凝胶颗粒），内部是多孔的网状结构。其交联度或孔度决定凝胶的分级分离范围。常用的凝胶：交联葡聚糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose，或Bio-GelA）、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）。

凝胶过滤的优点是分离条件温和，不影响样品的生物活性，样品损失小，回收率高，所以广泛用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化。目前已有将离子交换色谱与凝胶过滤两者结合起来，如DEAE-Sephadex、DEAE-Sepharose等，分离过程中既有电荷效应又有分子筛效应，对蛋白质的分离纯化更为有效。

2.根据蛋白质的溶解度分离

影响蛋白质溶解度的外部因素主要有溶液的pH、离子强度、介电常数、温度等。根据蛋白质这一性质分离的方法主要有以下几种。

（1）盐析（salting out）　硫酸铵、硫酸钠等中性盐因能破坏蛋白质在溶液中稳定存在的两大因素（盐类离子与水的亲和性大，又是强电解质，可与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质颗粒表面的水化膜；大量地中和蛋白质颗粒上的表面电荷），故能使蛋白质发生沉淀。不同蛋白质分子颗粒大小不同，亲水程度不同，故盐析所需要的盐浓度不同。如用硫酸铵分离清蛋白和球蛋白，在半饱和的硫酸铵溶液中，球蛋白即可从混合溶液中沉淀析出除掉，而清蛋白在饱和硫酸铵中才会沉淀。盐析的优点是不会使蛋白质发生变性。

盐析时所需的盐浓度称为盐析浓度，用饱和百分比表示。由于不同蛋白质的分子大小及带电状况各不相同，所以盐析浓度亦不同。因此，可以通过调节盐浓度使混合液中不同的蛋白质分别沉淀析出，称之为分段盐析。

（2）盐溶（salting in）　当在蛋白质溶液中加入中性盐的浓度较低时，蛋白质溶解度会增加，这种现象称为盐溶。这是由于蛋白质颗粒上吸附某种无机盐离子后，使蛋白质颗粒带同种电荷而相互排斥，并且与水分子的作用加强，从而使溶解度增加。

同样浓度的二价离子中性盐，如MgCl2、（NH4）2SO4对蛋白质溶解度影响的效果，要比单价中性盐如NaCl、NH4Cl等大得多，这与离子强度相关。

（3）有机溶剂分级分离法　凡能与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮等）均可用于沉淀蛋白质。有机溶剂能降低水的介电常数，使蛋白质分子间相互吸引而沉淀（库仑定律：介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的吸引力）；而其还能与蛋白质争夺水分子破坏其水化膜而使其沉淀分离。为防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高（30%～50%），且需要在低温条件下进行。

3.根据电荷差异分离

即根据蛋白质酸碱性质的不同分离蛋白质的技术方法，常包括电泳和离子交换色谱技术。带电颗粒在外加电场下，向着带相反电荷的电极发生移动的现象称为电泳或离子泳（ionphoresis）。蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中为带电颗粒，故可在电场中发生泳动。移动的方向和速度取决于所带净电荷的正负性、所带电荷的多少以及分子颗粒的大小和形状。由于各种蛋白质的等电点不同，所以在同一pH溶液中所带电荷不同，在电场中移动的方向和速度也各不相同，因此可以通过电泳的方法将混合的各种蛋白质分离开来。影响电泳迁移率的因素有很多，主要是：电位梯度、电流密度、导电性、环境pH（分子电荷）、离子强度、分子的大小和形状。根据电泳的原理和影响因素可以设计不同的电泳方法以达到预期的目的。

电泳有不同的分类方式。按照分离的原理电泳可以分为区带电泳、移动界面电泳、等速电泳和等电聚焦；按照支持物的有无又可以分为自由电泳和支持物电泳。

（1）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）　这是一种不加变性剂，直接以具有网络结构的聚丙烯酰胺凝胶为支持物分离天然蛋白质的凝胶电泳方法。主要根据电荷性质的不同，分子的大小和形状也起一定作用。尤其是用分子筛效应较明显的凝胶作支持物时，分子的大小和形状起着较大的作用。小的、近球形的分子迁移速度快。

（2）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）　利用变性剂SDS处理蛋白质后，在变性条件下进行的聚丙烯酰胺凝胶电泳，即“变性”电泳（图1-40）。SDS能破坏蛋白质分子的氢键和疏水作用，之后以烃链与蛋白质分子的侧链结合，结合比例为1.4g SDS/1g蛋白质。其分离依据为蛋白质分子的大小（质量）。SDS-PAGE的基本原理和特点如下。

① 蛋白质经还原剂处理后，二硫键断裂，非共价键相互作用被破坏，亚基分离。

② 蛋白质经SDS处理后带大量负电荷，掩盖了原来的电荷差异，且负电荷量与蛋白质分子量成比例。

③ 凝胶中的泳动速度仅取决于分子量的大小。在1万～20万范围内，迁移率（移动距离）与分子量的对数呈线性关系。

④ 可测定蛋白质的纯度、分子量及分子中的亚基数。

（3）等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）　是在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行的电泳，是一种具有高分辨率的自由界面电泳。

等电聚焦电泳技术就是在电泳支持介质中加入载体两性电解质，通以直流电后在正负极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，蛋白质在pH梯度凝胶中受电场力作用而泳动。当蛋白质分子一旦到达它的等电点位置，分子所带净电荷为0，就不能再迁移。因此蛋白质在与其本身pI相等的pH位置被聚焦成窄而稳定的区带。这种效应称之为“聚焦效应”，保证了蛋白质分离的高分辨率，是等电聚焦最为突出的优点。

pH梯度的形成依靠有缓冲作用的两性载体电解质，载体电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI分布在2.5～10.0，载体两性电解质溶液的pH大约是该溶液pH范围的平均值。在没有电流时，所有载体两性分子都带电荷，所带总的净电荷为0。

（4）双向电泳（two dimensional electrophoresis）（2-DE）　双向电泳（图1-41）是等电聚焦与SDS-PAGE结合得到的一种高分辨率的电泳方法，是当今蛋白质组学研究的重要技术。第一向：等电聚焦；第二向：SDS-PAGE，先后分别按蛋白质所带电荷和分子大小（质量）进行分离，分辨率提高。

电泳完毕，可用多种方法使蛋白质在2-DE凝胶中显现。常用的有：用显色剂（如考马斯亮蓝、AgNO3）浸染后可显示出蛋白质组分区带；也用免疫印迹法，即将凝胶上的蛋白质电转移至硝酸纤维素或尼龙膜片的过程。

4.根据物质的电离性质差异进行分离

被分离物质的离子与离子交换剂上的平衡离子进行交换，然后用适当的洗脱液进行洗脱。由于各种被分离物质离子的净电荷量不同，与载体上的可解离基团的结合力大小不同，所以被先后洗脱下来。色谱柱中填充的是能与溶液中的正离子或负离子进行交换的离子交换剂，由不溶性载体上共价连接可电离的基团制成。

在离子交换色谱中，蛋白质对离子交换的结合力取决于彼此间相反的电荷基团的静电吸引，因此与溶液的pH和盐浓度有关。蛋白质混合物的分离可以通过改变洗脱液的盐离子强度和pH来完成。改变洗脱剂的盐浓度和pH的方式有两种：一种是跳跃式的分段改变，称为分段洗脱（stepwise elution）；另一种是渐进式的连续改变，称为梯度洗脱（gradient elution），梯度洗脱一般分离效果好，分辨率高。

5.根据蛋白质与特定配体结合的亲和力分离

亲和色谱是利用蛋白质与配体的特异性亲和力而建立的色谱分离方法。其固定相是惰性的带有共价结合的配体基质，而配体（ligand）是能被生物大分子识别并与之结合的原子、原子团和分子。其基本原理和操作如下。

① 将配体共价结合于惰性多孔载体上（即固定化），灌装制成亲和色谱柱。

② 让蛋白质混合物流经色谱柱，使目的蛋白与配体结合。用缓冲液充分流洗，洗去不结合和非特异结合的杂蛋白。

③ 用含较高浓度游离（可溶）配体的缓冲液将特异结合的蛋白质（竞争）洗脱下来；或改变洗脱液的pH或盐浓度等，使目的蛋白与配体的结合力下降而被洗脱。

④ 透析除去目的蛋白质分子上的配体。

可用于亲和色谱的具有特异性亲和力的生物分子对主要有：酶与底物/抑制剂；受体与激素；抗体和抗原；抗体与蛋白质A；His标签与金属镍；GST标签与谷胱甘肽；蛋白质与染料；糖蛋白与植物凝集素（lectin）；特异结合蛋白与被结合的配体。

亲和色谱纯化过程简单、迅速、高效，有时能够“一柱到位”。对分离含量极少又不稳定的活性物质特别有效。

6.根据疏水性分离

疏水作用色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）也称疏水色谱，是利用蛋白质表面的非极性基团和介质上的非极性基团间的疏水作用来分离蛋白质的色谱方法。在水溶液中蛋白质表面的Leu、Val和Phe等非极性侧链形成疏水区，因而容易与介质上的疏水基团作用而被吸附。由于不同蛋白质分子的疏水区强弱有较大差异，造成与介质上的疏水基团间相互作用的强弱不同，改变色谱条件，使不同的蛋白质洗脱下来。

疏水作用色谱的介质一般以琼脂糖为母体，偶联上非极性基团，如苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等。离子浓度对疏水作用色谱有较大影响，高离子浓度会增加疏水作用，特别是硫酸铵效果尤为明显。因此疏水作用色谱一般在高浓度的硫酸铵存在下将蛋白质吸附在介质上，然后改变色谱条件，减弱疏水作用，如采用逐渐降低硫酸铵的浓度进行洗脱，这样可按蛋白质与介质的疏水作用的强弱程度将蛋白质分别洗脱下来，达到纯化的目的。

7.其他分离方法

（1）高效液相色谱（HPLC）　也称为高压液相色谱。它实际上是离子交换色谱、凝胶过滤、吸附色谱和分配色谱等技术的新发展。因此一方面它以这些色谱的原理为基础，另一方面在技术上作了很大的改进，使这些色谱有高效率、高分辨率和更快的过柱速度。HPLC已成为当前最通用、最有力和最多能的色谱形式。HPLC可用于蛋白质、氨基酸和其他生物分子的分析与制备。

（2）快速蛋白质液相色谱（FPLC）　由高流率代替了HPLC的高压力，并具有容量大和高分离度的双重特点，可使用各种色谱填料（载体）。在色谱过程中，上样、洗脱、收集、监控全部自动化，只要根据被分离物质的特性来选择不同的色谱填料，设置操作程序，所有操作全部自动完成。目前已广泛应用于蛋白质、多肽及重组质粒等的分离纯化。

（三）蛋白质分离纯化的一般注意事项

在进行任何一种蛋白质的纯化时，都要时刻注意维护它的稳定性，保护它的活性，有一些注意事项需要牢记，具体如下：

① 操作时尽可能置于冰上或者在冷库进行。

② 不要太稀，蛋白质浓度维持在μg/ml～mg/ml。

③ 合适的pH，除非是进行聚焦色谱，所使用的缓冲液pH避免与pI相同。

④ 使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解。

⑤ 避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防止蛋白质的变性。

⑥ 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。

⑦ 在缓冲液中加入0.1～1mmol/L DTT（或β-巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。

⑧ 加1～10mmol/L EDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。

⑨ 使用灭菌剂，防止微生物生长。

三、蛋白质的鉴定

用各种方法将蛋白质分离、纯化后，要对该蛋白质进行鉴定。主要包括纯度鉴定、分子量测定、含量测定、等电点及生物活性的测定等。

1.纯度鉴定

纯净的蛋白质样品通常不含其他杂蛋白和杂质。一般认为，当一种蛋白质被纯化到恒定的比活性以后或达到所谓的均一性以后，就认为是纯品了。然而，单凭恒定的比活性尚不够，还需要用其他方法加以验证。其他鉴定蛋白质纯度的方法如下。

（1）电泳法　如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦和毛细管电泳等，纯净的蛋白质电泳的结果应该是一条带。如果使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，则应特别小心，因为SDS能够破坏蛋白质的四级结构，如果一种蛋白质由不同的亚基组成，则会出现几条带。此外，电泳法检测蛋白质的纯度时，应取分布在蛋白质等电点两侧的两个不同的pH分别进行检测，这样得出的结论才可靠。

（2）化学法　N端测定，C端测定。纯品蛋白质应具有恒定的N端或C端组成。如果一种蛋白质只由一条链组成，则只会检测到一种N端或C端氨基酸。

（3）仪器法　HPLC或质谱分析仪。如果一种蛋白质样品在HPLC上只表示单一的峰，则可以视为纯品；如果纯化的是一种已知的蛋白质，经质谱分析测定出来的分子量与实际值一致，那么则可认为是纯品。

一般检测蛋白质的纯度必须综合两种机制不同的分析方法才能做出准确的判断。例如，一个用凝胶过滤和SDS-PAGE证明是纯的蛋白质的样品，由于这两种方法的机制是一样的，都是根据蛋白质的分子大小，因而此判断是欠考虑的。

2.分子量测定

（1）几个基本单位

① 分子量　用“Mr”表示，是该分子质量与C12原子质量的1/12的比值，既然是个比值，故它没有单位。

② 分子质量　它是分子的质量，用“m”表示，用道尔顿（Da）作单位，1Da=C12原子质量的1/12，1kDa=1×103Da，1MDa=1million daltons=1×106Da。

如一个分子的质量是水分子的1000倍，则可以说该分子：Mr=18000或m=18000Da=18kDa，但不能说：Mr=18000Da。

另外还有一个是原子质量单位“u”，1u=1.6606×10-24g，这种单位多见于质谱图中。

（2）测定方法

① 化学法　根据化学组成测定最低分子量，用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设分子中只有一个这种元素的原子，就可以计算出蛋白质的最低分子量。

例如，肌红蛋白含铁0.335%，其最低分子量可依下式计算：

最低分子量=铁的原子量÷铁的百分含量

计算结果为16700，与其他方法测定结果极为接近，可见肌红蛋白中只含一个铁原子。

真实分子量是最低分子量的n倍，n是蛋白质中铁原子的数目，肌红蛋白n=1。血红蛋白铁含量也是0.335%，最低分子量也是16700，因为含4个铁原子，所以n=4，因此其真实分子量为66800。

有时蛋白质分子中某种氨基酸含量很少，也可用这种方法计算最低分子量。如牛血清白蛋白含色氨酸0.58%，最低分子量为35200，用其他方法测得分子量为69000，所以其分子中含两个色氨酸。最低分子量只有与其他方法配合才能确定真实分子量。

② 凝胶过滤色谱法　物质分子的分子量大小与洗脱体积（Ve）有关，反过来可根据某物质的Ve或Ve/Vo推测出其分子量。

③ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量　前面谈到，蛋白质分子在介质电泳时，它的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等。1967年Shapiro等发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）和少量的巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与原来所带的电荷和分子形状无关，利用此则可以测定蛋白质的分子量。

④ 质谱仪测定蛋白质分子量　质谱测定蛋白质分子量是近年来发展的一项新技术，其分辨率和精确度都较前几项技术高。尤其近几年发展起来的磁质谱可精确测定分子质量2000Da以下的多肽；而电喷雾（ESI）质谱可以测50000Da的蛋白质，而且只需要皮摩尔（pmol）量的蛋白质，精确度为0.01%。

⑤ 沉降速度法测分子量　蛋白质溶液经高速离心分离时，由于密度关系，蛋白质分子趋于下沉，离心管底部的蛋白质浓度增高，这就是蛋白质的沉降作用（sedimentation）。每单位引力场沉降分子下沉的速率称为沉降常数，它表示沉降分子的大小特性。蛋白质分子量与沉降常数成正比，与扩散常数成反比，从蛋白质的沉降常数和扩散常数，即可求得蛋白质的分子量。

3.蛋白质含量测定

（1）凯式定氮法　蛋白质的平均含氮量为16%，这是蛋白质元素组成的一个特点，是凯式定氮法测定蛋白质含量的计算基础。

蛋白质含量=蛋白氮×6.25

式中　6.25——即16%的倒数，为1g氮所代表的蛋白质质量（g）。

（2）双缩脲法　用于需快速但不需十分精确地测定蛋白质含量。

（3）Folin-酚试剂法　蛋白质标准测定方法，基于Folin-酚试剂能与Cu+定量反应，而Cu+是由蛋白质的易氧化成分（如巯基、酚基）还原Cu2+产生的。

（4）紫外吸收法（280nm）　精度不高，操作简便。

（5）考马斯亮蓝结合法（Bradford法）　灵敏度高，微克（μg）水平，重复性也好。G250染料与蛋白质中的碱性氨基酸（Arg）和芳香族氨基酸结合，呈青色，A值与蛋白质含量呈线性关系。

对于特定蛋白组分的含量测定，通常采用特定的方法。比如，酶和激素等常采用酶活性或激素活性表示（比活性）。