2.7　蛋白质的分离与纯化

生物体内的蛋白质种类繁多，常以复杂的混合物形式存在于组织或细胞中。研究蛋白质的组成、结构、性质及功能，首先要获得一定量的蛋白质纯品；研究蛋白质的生物活性，又要使样品保持天然构象，避免变性。到目前为止还没有一个固定的方法能把一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，因此蛋白质的分离纯化是一项比较复杂的工作。

蛋白质的分离纯化设计思路依据各种蛋白质之间性质的差异，如蛋白质的溶解度、带电性质、吸附性质、分子大小以及与其他分子作用力不同。在分离纯化过程中要注意保持蛋白质的天然性状，防止蛋白质变性，通常分离纯化是在适宜的pH和较低的温度下进行。分离纯化主要分以下几个步骤。

①材料的预处理：对于组织或细胞中的蛋白质，首先要将生物组织或细胞进行破碎，使目的蛋白质从胞内释放出来，常用的破壁方法有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、渗透破碎法、微波法、冻融法和酶解法等。

②蛋白质的分离：经预处理得到的蛋白质溶液应根据目的蛋白质的性质，选用适合方法使其从杂蛋白中分离出来。常用的分离方法有：离心法、超滤法、等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法和凝胶过滤法等。

③蛋白质的纯化：混合在一起的性质相似的蛋白质还需要进一步纯化才能得到高纯度的目的蛋白质。常用的纯化方法有：凝胶色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法和电泳法等。

2.7.1　依据蛋白质分子大小的分离纯化方法

1）透析（dialysis）和超滤（ultrafiltration）

透析是依据蛋白质的胶体性质和不能透过半透膜的特点，将其与其他小分子物质（如无机盐、小分子糖、小肽等）分开。将待分离蛋白质溶液装入用半透膜制成的透析袋中，再将透析袋放在透析液（蒸馏水或缓冲液）中，使小分子渗出，蛋白质则保留在半透膜内。常用的半透膜是玻璃纸或高分子聚合物，已有能分离不同分子量蛋白质的商品化透析袋可供选择。超滤是利用压力或离心力迫使水和小分子透过半透膜的分离方式，蛋白质被截留在膜上，从而达到浓缩和脱盐的目的。目前超滤装置有加压、抽滤和离心等多种形式，所用超滤膜也有多种规格，可截留不同大小的蛋白质。通常用截割分子量（cut molecular weight，CMW）来表征超滤膜的孔径大小。

2）离心沉降法（ultracentrifugation）

将蛋白质溶液（通常加入适当沉淀剂）放在离心管内进行离心，由于蛋白质的密度大于溶液的密度，在强离心力作用下，蛋白质分子发生沉降，形成不同的区带。蛋白质颗粒的沉降速率与它的大小和密度等性质有关，改变离心速度，可以分离不同分子量的蛋白质。离心机有高速离心机（50000r/min以下）和超速离心机（60000r/min以上）。

3）凝胶过滤色谱

也称为凝胶色谱（gel chromatography）、分子筛色谱（molecular sieve chromatography）、分子排阻色谱（molecular exclusion chromatography）等，它是根据蛋白质分子量的大小对蛋白质混合物进行分离的一种有效方法。固定相介质通常是交联葡聚糖（cross-linked dextran），商品名为Sephadex，凝胶颗粒内部具有立体网状结构，形成很多孔穴，其交联度或网孔大小决定了凝胶的分级范围。当含有不同分子大小的蛋白质混合物进入凝胶色谱柱后，各个组分就向孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分的分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在凝胶颗粒孔外，所经过的有效体积小，它们经历的流程短，流动速度快，所以随流动相最先流出；较小的分子可以完全进入凝胶颗粒内部，经过的有效体积比较大，经历的流程长，所以最后流出；而大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子偏大的组分先流出，分子偏小的组分后流出。样品经过凝胶色谱后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到分离目的[图2.65（a）]。

凝胶色谱是生物化学中一种常用的分离手段，具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好和保持样品生物学活性等优点，被广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等方面。

2.7.2　依据蛋白质溶解度的分离纯化方法

1）等电点沉淀法

根据不同的蛋白质在其等电点处溶解度最小的性质进行分离的方法。当蛋白质分子处于等电点时，其净电荷为零，分子之间的静电排斥力很小而聚集形成沉淀。将蛋白质混合溶液的pH调到某一成分的等电点时，该蛋白质从溶液中沉淀出来，而其他组分大部分仍留在溶液中，也有少量随之共沉淀，所以这种方法难以得到纯品蛋白质。

2）盐析法

蛋白质的溶解度与溶液中中性盐的浓度有关，在高浓度的中性盐溶液中，蛋白质表面的水化层被破坏，表面电荷被中和，蛋白质分子间易发生聚集，从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析（salting out）。随着中性盐浓度的增加，蛋白质的疏水表面进一步暴露，蛋白质因疏水作用而聚集沉淀，所以最先沉淀出来的蛋白质是表面上疏水残基最多的蛋白质。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和磷酸钾等。盐析法是混合蛋白质分离纯化中常用的方法，如鸡蛋清的卵清蛋白就是用这种方法得到的。

3）有机溶剂沉淀法

利用中性有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮）与水的亲和力强，能破坏蛋白质的水化层，使蛋白质在水溶液中的溶解度降低，致使聚集而沉淀出来。由于这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，还可导致变性，所以在分离纯化操作过程中，有机溶剂浓度不能过高，而且需要在低温条件下缓慢进行。

2.7.3　依据蛋白质带电性的分离纯化方法

1）电泳（electrophoresis）

在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。这些带电颗粒在电场中的移动速度与它的电荷密度、大小及形状成正比关系，利用蛋白质分子所带净电荷的差异可以进行分离纯化。电泳技术广泛应用于氨基酸、多肽、蛋白质以及核酸、复合脂肪酸等生物分子的分析、分离和制备。

蛋白质在溶液pH不等于等电点时，蛋白质颗粒都带有不同程度的电荷。带电颗粒在电场中移动的速率（v）与电场强度（E）和所带净电荷（q）成正比，与介质的摩擦系数（f）成反比。摩擦系数（f）与颗粒的形状、大小和介质的黏度有关，主要取决于蛋白质颗粒的大小。

v=Eq/f

电泳分离蛋白质是将蛋白质样品加到凝胶介质上，在凝胶两端加上电场，使带电蛋白质在电场中迁移，从而达到分离蛋白质的目的（图2.66）。这种方式称为凝胶电泳（gel electrophoresis），凝胶介质常用聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）、琼脂糖凝胶（agarosegel）等。电泳可以分离微量的蛋白质样品，可以粗略测定蛋白质的分子量及等电点，但在电泳过程中，蛋白质的结构易受到破坏。电泳的类型有很多，这里介绍几种常用的电泳技术。

①SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子的大小、形状和所带电荷的多少。所用的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）是一种阴离子表面活性剂，可使蛋白质变性，并将多个亚基的蛋白质解离成单亚基。该技术是将蛋白质样品经SDS和还原剂巯基乙醇处理，巯基乙醇切断蛋白质中的二硫键，蛋白质解离成单条肽链，由于SDS是带有负电荷的分子，其疏水部分与肽链中疏水侧链按大约1:2比例结合，使蛋白质分子带上大量的负电荷（此时蛋白质分子原有电荷可忽略），并且使结合SDS的蛋白质分子形状变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的带电荷量和分子形状的差异，这样在聚丙烯酰胺凝胶中的泳动速度只取决于蛋白质分子量的大小。组分中各种蛋白质的迁移率反映在电泳后的凝胶上，凝胶通过染色（常用考马斯亮蓝染色或银染等）出现不同的条带。蛋白质分子在电泳中的相对迁移率和分子量的对数成线性关系，肽链越长，迁移速度越慢。未知的蛋白质分子量（准确说是多肽链的分子量）通过与同一块凝胶上的标准蛋白质迁移率进行比较就可以计算出来，所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。

②等电点聚焦（isoelectric focusing，IEF）电泳是一种高分辨率的蛋白质分离技术，也可用于蛋白质等电点的测定。该技术是利用一种特殊的缓冲液（两性电解质）在聚丙烯酰胺凝胶内制造一个pH梯度，将蛋白质样品加入到凝胶中进行电泳时，每种蛋白质将迁移到它的等电点（pI）对应的梯度pH处聚集，染色后可以看到不同等电点的蛋白质在凝胶中形成一个区带，达到分离蛋白质的目的。所用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，称为两性电解质，它们具有相近但不相同的pKa和pI值，在外电场的作用下形成pH梯度。

③双向电泳（two-dimensional electrophoresis）又称二维电泳，是将等电点聚焦电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结合起来的电泳技术，首先将蛋白质样品进行等电点聚焦电泳，然后将胶旋转90°进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。双向电泳的凝胶经染色后蛋白质呈二维分布，水平方向呈现出相同分子量而等电点不同的蛋白质组分，垂直方向呈现出等电点相同而分子量不同的蛋白质组分，因此双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分离开，其分辨率更高。双向电泳是蛋白质组学研究的常用方法。

④毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）是指离子或带电粒子以毛细管为分离室，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离和分析技术。由于毛细管内径小（通常内径50μm，外径300μm），表面积和体积的比值大，易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这是CE和传统电泳技术的根本区别。该技术泛指高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳和毛细管电泳，不仅可以分离蛋白质、多肽、氨基酸，还可以用于DNA片段、核酸、多种小分子以及手性化合物的分离。

2）离子交换色谱（ion-exchange chromatography）

离子交换色谱也称为离子交换柱色谱，是利用不同蛋白质在一定pH溶液中所带的电荷不同，与离子交换树脂或介质上的离子发生交换而进行的一种分离方法[图2.65（b）]。根据离子交换树脂的性质可分为两大类：表面呈负电荷、对阳离子有保留的树脂称为阳离子交换树脂，如羧甲基纤维素（CM-纤维素），含有带负电荷的固定相（羧基骨架）和带正电荷的交换相（羧甲基上解离下来的H+）；表面呈正电荷、对阴离子有吸附作用的树脂称为阴离子交换树脂，如二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素），树脂上带有正电荷基团，可与溶液中的带负电荷的蛋白质结合。

蛋白质与离子交换树脂之间的结合能力取决于两者带电基团间的静电吸引。当溶液pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质颗粒带有正电荷，带正电荷的蛋白质分子可与阳离子交换基团（如H+）进行离子交换而被吸附在树脂上，带正电荷越多的蛋白质与树脂结合越强，带正电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱，可以选用不同浓度的阳离子洗脱液（如NaCl溶液）进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，将带不同电荷的蛋白质进行分离，因此洗出的顺序大体是酸性蛋白质、中性蛋白质、碱性蛋白质。阴离子交换树脂的洗出顺序与之相反。

2.7.4　依据蛋白质吸附性质的分离纯化方法

1）亲和色谱（affinity chromatography）

亲和色谱[图2.65（c）]是一种特异性吸附色谱。在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合等，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种特异性结合能力称为亲和力。将具有特殊结构的亲和分子或配基（ligand）固定于吸附剂上，当含有目标蛋白质的混合液通过色谱柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在色谱柱中；那些没有亲和力的蛋白质将直接流出，从而与目标蛋白质分开；然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将目标蛋白质洗脱下来。这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和色谱，具有高效、快速、简便等优点。

2）吸附色谱（adsorption chromatography）

根据不同组分在吸附剂表面吸附和解吸能力的差异来进行分离的色谱法，包括气固吸附色谱和液固吸附色谱。极性越强的组分在吸附剂上滞留时间越长。常用的固定相有强极性的硅胶、弱极性的氧化铝、非极性的活性炭和特殊组成的分子筛等。

3）疏水作用色谱（hydrophobic interaction chromatography）

根据不同蛋白质表面的氨基酸残基疏水性的差异进行的一种分离纯化方法。蛋白质表面含有的疏水性氨基酸残基数目和空间分布决定了蛋白质与疏水填料具有不同的结合能力，从而达到分离效果。通常在高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱，因此该方法较适用于盐析后的母液及沉淀蛋白质用盐溶解后的溶液直接在柱上分离。

除以上分离纯化方法外，还有一些方法，如高效液相色谱（HPLC）、反相HPLC（reversed-phase HPLC）和快速蛋白质液相色谱（fast protein liquid chromatograpy，FPLC）等具有高效率、高分辨率和快速等特点，广泛应用于蛋白质分离纯化中。

2.7.5　蛋白质含量和纯度的测定

在蛋白质研究过程中，分离纯化前后需要检测样品中总蛋白质含量、某种蛋白质含量以及蛋白质最终纯化程度。一般测定蛋白质总含量的方法有：凯氏（Kjeldahl）定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法和考马斯亮蓝法（Bradford法）等。

凯氏定氮法是将含蛋白质的样品与浓硫酸共热，使分解出的氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱消化液，使硫酸铵分解出氨，用水蒸气蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量（mol）相当于被测样品中氨的量（mol），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。

双缩脲法的原理基于蛋白质含有两个以上的肽键（—CO—NH—），在碱性溶液中能与Cu2+形成络合物。Lowry法是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂（磷钼酸-磷钨酸试剂），蛋白质-铜络合物能还原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定范围内，蓝色强度与蛋白质的含量成正比。该方法的优点是操作简便、灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10～20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是反应受多种因素干扰。

紫外吸收法是根据蛋白质分子在紫外280nm处有特征吸收，蛋白质溶液的光吸收值（OD280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。

二羧基二喹啉试剂或称二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA），是近年开发的一种测定蛋白质含量的试剂。碱性条件下，蛋白质将Cu2+还原成Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，计算待测蛋白质的浓度。

考马斯亮蓝法（Coomassie brilliant blue）又称Bradford法，是在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该方法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高，比Lowry法灵敏4倍。

测定蛋白质样品中某种蛋白质的含量需要具有高度特异性的方法。可以利用抗原-抗体反应测定某种特定蛋白质的含量，也可以通过测定酶或激素类蛋白质的活性来确定特定蛋白质的含量。对于酶来讲，可以用生物活性与总蛋白质含量之比（比活性）来表示其纯度。

蛋白质纯度的测定通常采用各种电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等方法，在分析图谱中出现单一峰或单一条带都可说明样品是纯的；还有用N端分析方法，如得到单链蛋白也可说明该蛋白质是纯品。但是值得注意的是，任何一种方法测定的结果都只能认为是蛋白质分子均一性的必要条件而不是充分条件。