2.5　蛋白质的氨基酸序列测定

蛋白质一级结构是指多肽链的氨基酸顺序，该顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。第一个被测序的蛋白质是牛胰岛素，由英国剑桥大学的Frederick Sanger于1953年完成，先后用了十年的时间，1958年获得诺贝尔化学奖。至今已确定了成千上万种蛋白质的氨基酸序列，其中一部分是由Sanger方法测定的，大部分是根据编码蛋白质的基因核苷酸序列推导出来的。目前蛋白质序列分析的自动化程度也大大提高，蛋白质自动序列分析仪的原理是根据Edman方法设计的。

蛋白质氨基酸序列的确定具有重要的意义：①氨基酸序列是决定蛋白质空间结构的基础，可由一级结构推测多肽链在空间的折叠状况，预测其高级结构；②测定蛋白质一级结构是阐明蛋白质分子机制的基础，进而可了解其生物活性的作用机制；③蛋白质一级结构的改变会影响到高级结构，可导致蛋白质的功能异常或引发病变；④通过对来源不同物种蛋白质序列的测定，可分析各种蛋白质的氨基酸序列差异，揭示生物体之间的进化关系。

氨基酸序列测定主要包括如下七个方面。

（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目

在蛋白质分子量已知的前提下，根据N端或C端氨基酸残基的物质的量和蛋白质的物质的量可以确定分子中所含有的肽链数目。

（2）拆分蛋白质分子的多肽链，断开链间及链内二硫键

两条或两条以上多肽链之间非共价键的拆分可使用变性剂（如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍等），链间二硫键断开可用氧化剂（过甲氧酸）或还原剂（巯基乙醇）。拆分开的多个肽链可根据分子量大小或带电性质差异进行进一步分离。

（3）分析每一条肽链的氨基酸组成

对每一条肽链进行完全水解（包括酸水解和碱水解），通过氨基酸分析仪测定氨基酸种类、数目及每种氨基酸的含量。

（4）选择性降解多肽链并测定肽段的氨基酸序列

当组成多肽链的氨基酸残基数过多时，必须先采用酶降解法或化学降解法，使肽链裂解成可测序的小片段。

①采用酶降解法使肽链裂解所选用的酶有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶。

胰蛋白酶：是由胰腺产生的消化酶，可专一性水解Lys和Arg羧基形成的肽键，但当Lys和Arg羧基与Pro连接时，肽键不能被水解[图2.51（a）]。

胰凝乳蛋白酶（也称糜蛋白酶）：专一性水解芳香族氨基酸（Phe、Tyr和Trp）和分支状氨基酸（Leu、Ile和Val）的羧基形成的肽键，但其羧基与Pro连接时，也不能被水解[图2.51（b）]。

胃蛋白酶：没有专一性，只要求断裂肽键两侧的氨基酸残基都是疏水性氨基酸。胃蛋白酶的最适pH是2。

②采用化学降解法使肽链裂解常选用溴化氰：溴化氰（CNBr）专一性水解甲硫氨酸羧基形成的肽键。该方法的特点是专一性强，产率高。反应如图2.52。

（5）确定末端氨基酸残基

①确定N端氨基酸方法二硝基氟苯（DNFB）法、丹磺酰氯（DNS-Cl）法和苯异硫氰酸酯（PITC）法都可以用来测定肽链N末端氨基酸（反应见2.1.4。

DNFB法只与肽链的N端氨基酸生成衍生物，而肽链中其余的氨基酸残基都被水解成游离氨基酸。生成的DNP-氨基酸溶于乙酸乙酯，可以用乙酸乙酯抽提分离出来，不同的DNP-氨基酸可进行色谱分析并与标准品对照鉴定，由此确定肽链的N端氨基酸。

DNS-Cl法的原理与DNFB法基本相同，生成的DNS-氨基酸具有荧光性质，可用色谱分析检测。

PITC法是P.Edman在1950年提出来的，所以又称为Edman反应或Edman化学降解法。反应生成PTH-氨基酸和N端少一个氨基酸的肽链，反应可以循环进行，每次循环去掉N端一个氨基酸残基，得到一个PTH-氨基酸，直至完成肽链所有氨基酸顺序的测定。多肽顺序自动分析仪就是根据该反应原理设计的。

②确定C端氨基酸方法肼解（hydrazinolysis）法是目前测定C端氨基酸常用的方法。多肽与无水肼（NH2NH2）加热，除C端氨基酸以游离形式存在外，其余氨基酸则变成相应氨基酸酰肼。氨基酸酰肼与苯甲醛缩合成不溶于水的二苯基衍生物，从而与C端氨基酸分离。再将得到的C端氨基酸与DNFB反应，经色谱分析鉴定该氨基酸。

羧肽酶法（carboxypeptidase method，CPE法）：羧肽酶是一种肽链外切酶，可专一地从肽链C端逐一降解，使氨基酸以游离形式被释放出来。常用的羧肽酶有羧肽酶A和羧肽酶B。羧肽酶A：当C端是Arg、Lys和Pro时，或C端氨基酸与Pro连接时，该酶不能起到水解作用。羧肽酶B：只能水解C端是Arg和Lys，条件是这两个氨基酸不能与Pro相连。

（6）重建完整肽链序列

多肽链中每个片段被完成测序后，还要确定它们在原始肽链中的顺序，因此需要多种不同方法断裂原始肽链，以得到多套片段，再对具有重叠区域的片段氨基酸序列进行比较，最终确定原始多肽链的全序列（图2.53）。

（7）确定二硫键位置

多肽链的氨基酸序列分析最后一步是判断链间或链内的二硫键位置。一般采用胃蛋白酶水解样品，理由有两点：①胃蛋白酶专一性较差，切点较多，水解生成的片段较短，易于下一步的分离和鉴别；②胃蛋白酶的最适pH是2，二硫键在酸性条件下不被破坏，保证分析正确性。

确定二硫键位置可以使用对角线电泳（diagonal electrophoresis）方法进行分离。具体方法是（图2.54）：将酶解后得到的混合肽段点在滤纸中央，在pH6.5的条件下，进行第一向电泳；然后把滤纸放在过甲酸蒸气中熏一段时间，使二硫键断裂；再将滤纸旋转90°，在相同条件下进行第二向电泳。所得到的结果是：不含二硫键的肽段两次电泳图谱一样，代表肽段的斑点出现在对角线上，而含二硫键的肽段被过甲酸氧化为含有磺基丙氨酸[—NH—CH（）—CO—]的肽段，所带负电荷增加，两次电泳的行为不同，斑点偏离了对角线。采集不在对角线的斑点，进行氨基酸序列分析，从而推断出二硫键在链间或链内的位置。