第五节　小胶质细胞功能实验

小胶质细胞作为脑内常驻的免疫细胞，主要参与中枢神经系统的免疫和炎症反应，当脑内微环境发生变化（如错误折叠蛋白、脑损伤或外源性免疫刺激）时，可迅速应激转化成为具有变形和吞噬能力的激活状态。阿尔茨海默病是一种最常见的神经变性痴呆，而帕金森病则是最常见的一种运动障碍性疾病。尽管两种疾病的发病原因和病理改变不同，但胶质细胞活化和神经元的丢失都是其典型的病理特征之一，小胶质细胞引起的神经炎症、趋化和迁移与吞噬功能的改变与其密切相关。在这些复杂的病理生理变化过程中小胶质细胞是否发生吞噬功能改变和清除能力障碍常是我们关注的问题。本节就体外实验测定小胶质细胞趋化、迁移、吞噬功能做一介绍。

一、趋化和迁移实验

1.材料

96孔细胞培养板、96孔收获板等耗材，96 孔细胞迁移板（购自Cell biolabs Inc.，Cat No. CBA-106），无血清培养基，10%胎牛血清，细胞裂解液。

2.操作步骤（图1-18、图1-19）

（1）从4℃冰箱中取出96孔细胞迁移板，使其在室温下平衡10min。

（2）制备小胶质细胞悬液，每毫升无血清培养基中含（0.1～1.0）×106 个细胞。

（3）无菌环境下，将96孔迁移板盖子和聚碳酸酯膜层分开，向下室加入150ml含10%胎牛血清的溶液。

（4）将聚碳酸酯膜层放到下室96孔细胞培养板上（要确保下室的溶液中无气泡），混匀小胶质细胞悬液，吸取100ml置于上室中，盖好板于37℃培养箱中孵育2～24h。

（5）结束孵育后，用吸头吸取150ml预热的细胞分离液到无菌的96孔收获板中。

（6）从培养箱中取出96孔细胞迁移板，取下中间聚碳酸酯膜层，轻柔涤荡数次使膜上细胞进入到96孔收获板的细胞裂解液中，放入37℃培养箱继续反应30min。

（7）用4×细胞裂解液以1∶75比例稀释荧光染料。

（8）吸取50ml/每孔稀释液到96孔细胞培养板中，室温下孵育20min。

（9）吸取150ml混合液到96孔细胞培养板，于480nm/520nm下波长下测定迁移率。

二、体外测定小胶质细胞吞噬功能（吞噬尼罗红微球/α突触核蛋白/Aβ）

1.材料

细胞培养板、玻片、离心管、吸头等相关耗材，全部购自Nuck公司。培养基和溶液DMEM高糖细胞培养基，HBSS（购自Invitrogen），胎牛血清、胰蛋白酶（购自Hyclone）；重组体人Hilyte™ Fluor488-α-突触核蛋白1-140（货号55457）；重组体人Hilyte555-Aβl-42（购自Anaspec Inc.，货号60480）。α-突触核蛋白A53T突变体（购自Rpeptide，货号S-1002-2）；α-突触核蛋白WT（购自Rpeptide，货号S-1001-2）、AlexaFluor488鬼笔环肽（购自Invitrogen）。

2.操作步骤

（1）制备聚合状态的α-突触核蛋白

① Syn/磷酸盐缓冲液：37℃中以1mg/ml（70μmol/L）溶解，260转/分持续震荡14天。

② 将α-突触核蛋白（Syn）/磷酸盐缓冲液稀释为1μmol/L孵育30～60min做核转位（如NFATs），测定吞噬作用则孵育4h；测定炎症反应则孵育4～18h。

（2）制备聚合状态的Aβ： 1.0mg的Aβ（货号60480）用100%的六氟异丙醇（HFIP）溶解配制成1mmol/L，通风橱内风干，加入42ml的二甲亚砜溶解，再加入2173ml HBSS，配成母液浓度100μmol/L的Aβ漩涡或超声混匀即得到单体可溶性Aβ，放于37℃培养箱孵育7天即为纤丝状。

（3）小胶质细胞吞噬尼罗红荧光微球

① 多孔板荧光测定

·将小胶质细胞接种于96孔细胞培养板（每孔5×104个细胞），在不含血清的α-突触核蛋白中分别孵育4h和18h。

·溶解尼罗红荧光微球（购自Invitrogen），使其浓度为0.03%（用0.1%牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲液孵育的尼罗红按1∶70比例稀释）。

取15ml A混合溶液（1%牛血清白蛋白8ml+磷酸盐缓冲液152ml+0.03%尼罗红16ml）加入到1ml培养基中。

·将细胞分为两组：一组用荧光微球孵育；另一组不加荧光微球，各1h。

·为了去除细胞外或细胞外质膜相关的荧光微球的非特异性信号，去掉培养基后用含有0.25mg/ml台酚蓝的磷酸盐缓冲液将细胞孵育2min，再用磷酸盐缓冲液漂洗3次。

·用PBST（1% Triton-PBS）裂解细胞。

·用荧光成像读板仪测定细胞内的荧光微球，535nm波长荧光处激发，575nm发射。

② 吞噬细胞的图像定量分析

·将小胶质细胞接种于有盖玻片的24孔细胞培养板（每孔1×105个细胞），并用不同浓度的α-突触核蛋白处理，测定指定时间。

·按照如上方法加入尼罗红荧光微球。

·用磷酸盐缓冲液漂洗细胞并于2%～4%的多聚甲醛中固定。

·加入AlexaFluor488鬼笔环肽（购自Invitrogen），于室温孵育1h。用4′，6-二脒基-2苯基吲哚（DAPI）或Topro-3进行核染色。

·共聚焦显微镜扫描定量（购自Zeiss，型号LSM510），见图1-20。

·用PBST（1% Triton-PBS）裂解细胞。

（4）小胶质细胞对于α-突触核蛋白或Aβ的吞噬作用

① 多孔板荧光测定

·从不同基因型的小鼠获得的原代小胶质细胞接种于96孔细胞培养板（每孔5×104个细胞），24h后，加入浓度为500μmol/L的荧光标记的α-突触核蛋白中37℃处理4h；或加入5μm纤丝状Aβ在37℃培养箱孵育30min。

·为了终止细胞外或者细胞外质膜相关的荧光α-突触核蛋白/Aβ或非特异性信号，去掉培养基然后用含有0.25mg/ml台酚蓝的磷酸盐缓冲液终止2min，再用磷酸盐缓冲液漂洗2次。

·用荧光成像读板仪测定细胞内的荧光微球，激发波长和发射波长分别为503nm/525nm（或者相应波长的红色荧光波段）。

② 图像分析小胶质细胞的吞噬作用

·将小胶质细胞接种于有盖玻片的24孔细胞培养板（每孔1×105个细胞），并用不同聚合状态的α-突触核蛋白/Aβ处理预定时间，去除上清液。

·加入浓度为500nmol/L的荧光标记的α-突触核蛋白或Aβ，37℃孵育，4h。

·为了终止细胞外或细胞外质膜相关的荧光α-突触核蛋白/Aβ或非特异性信号，去培养基，然后用含有0.25mg/ml台酚蓝的磷酸盐缓冲液终止2min，再用磷酸盐缓冲液漂洗2次。

·用磷酸盐缓冲液漂洗细胞并于2%～4%的多聚甲醛中固定。

·加入AlexaFluor488鬼笔环肽或者555鬼笔环肽（购自Invitrogen），并于室温下孵育1h。用4′，6-二脒基-2苯基吲哚（DAPI）或Topro-3进行核染色。

·共聚焦显微镜下定量（购自Zeiss，型号LSM510），然后用软件Image J进行小胶质细胞的区域分布和密度分析（图1-21）。

HilyteTM Fluor 488人α-突触核蛋白以1mg/ml浓度冰冻保存于10mmol/L磷酸钠缓冲液中（pH=7.0）。如果一周内使用则保存在2～4℃下，于-80℃下可保存12个月。避光保存且避免冻融循环。

（潘晓东　宋　悦）