第二节　紫外-可见分光光度计

一、基本结构

在紫外-可见光区，能够任意选择不同波长的光用来测定吸光性物质溶液的吸光度（或透光率）的仪器，称为紫外-可见分光光度计，外观见彩色插图4。这类仪器的型号繁多，外形各异，质量差别很大，但其基本结构和工作原理相似，都是由光源、单色光器、吸收池、检测器和信号处理及显示器五个主要部分组成，如图4-6所示。

1.光源

光源是提供入射光的装置。一般要求光源能够发射出强度足够而且稳定的连续光谱，辐射能量随波长的变化尽可能小，光源使用寿命长。不同光源可以提供不同波长范围的光波，紫外-可见分光光度计常用的光源有两类。

（1）热辐射光源　在可见光区常用的热辐射光源有钨灯和卤钨灯。钨灯又称白炽灯，卤钨灯是在钨灯灯泡内填充碘或溴的低压蒸气，由于灯内卤元素的存在，减少了钨原子的蒸发，故能够延长灯的使用寿命，且发光效率明显提高。钨灯或卤钨灯可以发射波长范围为360～800nm的连续光谱，主要用于可见光区的测定。

（2）气体放电光源　气体放电光源一般用于紫外光区，如氢灯或氘灯，可以发射波长范围为150～400nm的连续光谱，主要用于紫外光区的测定。

2.单色光器

单色光器简称单色器，是将光源发射的复合光按波长顺序色散分解成单色光，并可从中选出所需波长单色光的光学系统。单色器的性能直接影响入射光的单色性，从而影响到测定的灵敏度、准确度、选择性及标准曲线的线性关系等。单色器由进光狭缝、准直镜、色散元件和出光狭缝四个部件组成，其光路原理如图4-7所示。

光源发出的复合光，经聚光后进入进光狭缝，经准直镜变成平行光，投射于色散元件，不同波长的平行光有不同的投射方向（或偏转角度）形成按波长顺序排列的光谱，再经准直镜将色散后的单色光聚焦于出光狭缝。转动色散元件的方向，可使所需波长的单色光从出光狭缝射出，再经透镜后变成平行的单色光。

（1）色散元件　色散元件是单色光器的核心部件，起到分光的作用。常用的有棱镜和光栅两种。

棱镜的色散作用是利用棱镜材料对不同波长光的折射率不同，将复合光按波长从短到长依次分散成一个连续光谱。棱镜可用玻璃或石英材料制得，玻璃棱镜对可见光的色散较好，但会吸收紫外光，故只适用于可见光区域；石英棱镜对紫外光的色散好，且不吸收紫外光，所以，适用于紫外光区域。棱镜对光的色散率随波长的不同而改变，按波长排列，疏密不均，短波长区域疏，长波长区域密。

光栅是一种在高度抛光的玻璃或合金表面上刻有许多等宽、等距的平行条痕的色散元件。在紫外-可见光区所用的光栅一般每毫米刻有大约1200个条痕。它是利用复合光通过条痕狭缝反射后，产生光的衍射和干涉作用来对光进行色散的。光栅的分辨率比棱镜高，使用波长范围宽，色散率基本上不随波长而改变，可用于紫外、可见、近红外光等光谱区域。

（2）准直镜　准直镜是以狭缝为焦点的聚光镜。其作用是将进入单色光器的发散光转变成平行光，再将色散后的单色光聚焦于出光狭缝。

（3）狭缝　狭缝是光的进、出口，是单色器的重要组成部分之一，关系到分辨率的优劣，直接影响分光质量。它是由具有很锐刀口的两个金属片精密加工制成的，两个刀口之间必须严格平行，并且处在相同的平面上。进光狭缝的作用是限制杂散光进入单色光器，出光狭缝的作用是将所需要的单色光波射出单色光器。狭缝过宽，获得的单色光不纯，影响吸光度的测定。狭缝的宽度越窄，获得的单色光就越纯，但是，光通量和光的强度同时变小，会降低测定的灵敏度。因此，测定时要调节适当的狭缝宽度。

3.吸收池

用来盛放溶液的容器称为吸收池，也叫比色皿或比色杯。在可见光区测定时，可用光学玻璃材质制成的吸收池；在紫外光区测定时，必须使用石英材质制成的吸收池。用于盛放参比溶液和待测溶液的吸收池应该相互匹配，即测定条件不变，盛放同一溶液测定透光率，其相对误差应小于0.5％。吸收池有两个透光面，其内壁和外壁都要特别注意保护，避免摩擦，避免留下指纹、痕迹、油腻和污物。如果外壁沾有残液，只能用镜头纸或绢布吸干。

4.检测器

检测器是将通过吸收池的光信号转换为光电信号的电子元件，常用的有光电池、光电管和光电倍增管。近年来，有些紫外-可见分光光度计采用了二极管阵列检测器和多道检测器。

（1）光电管　光电管是由一个丝状阳极和一个光敏阴极组成的真空（或充少量惰性气体）二极管。光敏阴极的凹面镀有一层碱金属或碱金属氧化物等光敏材料，受光照射时能够发射电子，流向阳极而形成电流，称为光电流。照射光的强度越大，形成的光电流也越大。如图4-8所示。光电管输出的电信号很弱，需经放大后输入显示器。

（2）光电倍增管　光电倍增管的工作原理与光电管相似，其差别是在光敏阴极和阳极之间多了几个倍增级（一般是九个），各倍增级之间的电压依次增高90V，如图4-9所示。

阴极被光照射后发射电子，电子被第一倍增级的高电压加速并撞击其表面时，能够发射出更多的电子。如此经过多个倍增级后，发射的电子大大增加，被阳极收集后，能够产生较强的光电流。此电流还可以进一步被放大，从而增加检测的灵敏度。光电倍增管可以检测弱光，但不能用于检测强光。

5.信号处理及显示器

信号处理及显示器可以将检测器的输出信号，以适当的方式显示或记录下来。常用的显示器有电表指示、数字显示、荧光屏显示、曲线描绘和打印输出等。显示的测定数据结果有透光率和吸光度，有的还显示浓度、吸收系数等。

指针式显示器用的是微安电表，在微安电表的标尺上刻有透光率和吸光度两种刻度，透光率的刻度从左到右为0～100等分，吸光度的刻度从左到右为∞～0不等距刻线。据公式（4-4）得知，当T=0时，A=∞；当T=100％，A=0。

数字显示可直接显示透光率（T）或吸光度（A），甚至可以显示溶液浓度（c）。很多型号的紫外-可见分光光度计装配有微机处理机，可以对紫外-可见分光光度计进行操作控制，同时可以进行数据处理。

课堂互动

为什么透光率的刻度为等分刻度，而相对应的吸光度为不等分刻度呢？

二、操作步骤

紫外-可见分光光度计型号不同，操作步骤略有不同，基本步骤如下。

（1）开机前检查仪器是否正常，如检查样品室内有无挡光物。

（2）分别开启紫外-可见分光光度计主机和计算机电源，从计算机桌面进入操作程序。

（3）点击“连接”进入紫外-可见分光光度计自检系统，自检过程中，切勿开启样品室门，自检无误后进入主工作程序。

（4）编辑测定方法，输入所需数据。

（5）用纯化水分别清洗2个石英比色杯（手拿磨砂面）3次，再用空白溶液各洗3次，分别装入2/3的空白溶液，用镜头纸将比色杯外壁溶液吸干。

（6）打开样品室门，分别将比色杯放入样品池及参比池中，即置各自光路中，关好样品室门。进行零点校正。

（7）将样品池中空白溶液更换为供试品溶液，置光路中，关好样品室门，测量吸光度值或吸收光谱曲线。

（8）关闭操作程序、紫外-可见分光光度计和计算机电源。清洗比色杯。

紫外-可见分光光度计使用注意事项如下。

（1）检测器预热时必须等待所有指示灯变为绿色，才可进行下一步操作。

（2）放入比色杯时务必小心轻放，确保比色杯已完全进入光路中。

（3）必须扫描基线，空白溶液即未加样品的溶液，必须与样品溶液一致。

（4）扫描过程中切忌打开或试图打开样品室门。

三、主要性能指标

紫外-可见分光光度计的光学性能可以从以下几个方面进行考查和比较。

1.测光方式

仪器显示的测定数据结果，如透光率、吸光度、浓度、吸收系数等。

2.波长范围

仪器可以提供测量光波的波长范围。可见分光光度计的波长范围一般为400～1000nm，紫外-可见分光光度计的波长范围一般为190～1100nm。

3.狭缝或光谱带宽

狭缝或光谱带宽是仪器单色光纯度指标之一，中档仪器的最小谱带宽度一般小于1nm。棱镜仪器的狭缝连续可调，光栅仪器的狭缝常常固定或分档调节。

4.杂散光

通常以光强度较弱处（如220nm或340nm处）所含杂散光强度的百分比作为指标。中档仪器一般不超过0.5％。

5.波长准确度

仪器显示的波长数值与单色光实际波长之间的误差，高档仪器可低于±0.2nm，中档仪器大约为±0.5nm，低档仪器可达±5nm。

6.吸光度范围

吸光度的测量范围，中档仪器一般为-0.1730～2.00。

7.波长重复性

重复使用同一波长时，单色光实际波长的变动值大约为波长准确度的1/2。

8.测光准确度

常以透光率误差范围表示，高档仪器可低于±0.1％，中档仪器不超过±0.5％，低档仪器可达±1％。

9.光度重复性

在相同测量条件下，重复测量吸光度值的变动性。此值大约为测光准确度的1/2。

10.分辨率

仪器能够分辨出最靠近的两条谱线间距的能力。高档仪器可低于0.1nm，中档仪器一般小于0.5nm。

四、仪器类型

根据光学系统的不同，将紫外-可见分光光度计分为单波长单光束分光光度计、单波长双光束分光光度计和双波长双光束分光光度计三大类。因为各类仪器的基本结构相似，所以，都配有卤钨灯和氘灯两种光源，卤钨灯的辐射波长为330～1000nm，氘灯的辐射波长为190～330nm，卤钨灯和氘灯的转换用手柄控制；单色光器的色散元件是一个平面光栅；吸收池由石英制成；检测器是PD硅光电池或光电倍增管；终端输出用数字显示浓度（c）、吸光度（A）和透光率（T），甚至显示吸收曲线和标准曲线，同时可以打印测量结果。

1.单波长单光束分光光度计

这类紫外-可见分光光度计的特点是从光源到检测器只有一束单色光，常用的有国产751型、752型、7530型、754型、UV755B型和TU-1810型，英产UnicamSP500型，美产BDU-2型，日产岛津QR-50型等。以UV755B型仪器为例，其外形及光路原理分别如图4-10和图4-11所示。

2.单波长双光束分光光度计

这类紫外-可见分光光度计的特点是从单色光器发射一束单色光，经过一个旋转的扇面镜（斩光器）将它分成波长相同的两束单色光，交替通过参比溶液和样品溶液后，再用一个同步旋转的扇面镜（斩光器）将两束透过光交替地照射到光电倍增管上，使光电倍增管产生一个交变的脉冲信号，经过比较放大后，由显示器显示出透光率、吸光度和浓度等，或者进行波长扫描，记录吸收光谱。此类仪器有国产710型、730型、740型等；国外产品有英产UnicamSP700型，日产岛津UV-200型和UV-240型等。这类仪器的光路原理如图4-12所示。

3.双波长双光束分光光度计

这类紫外-可见分光光度计的特点是仪器采用两个并列的单色光器，分别产生波长不同的两束单色光，交替照射同一样品溶液，得到同一样品溶液对不同波长单色光的吸光度差值。其优点是，测定时不需要参比池，可以避免吸收池不匹配、参比溶液与试样溶液的折射率和散射作用不同而产生的误差，特别适于在有背景吸收干扰或者有共存组分吸收干扰的情况下，对某组分进行定量测定。另外，此类仪器除了以双波长的方式工作外，还可以用单波长双光束的方式工作。此类仪器有国产WFZ800-S型、日产岛津UV-300型等。这类仪器的光路原理如图4-13所示。