第二节　紫外-可见分光光度计

在紫外及可见光区内，用于测定溶液吸光度的分析仪器称为紫外-可见分光光度计，简称分光光度计。分光光度计的工作原理是采用一个可以产生多个波长的装置，通过系列分光装置，得到一束平行的波长范围很窄的单色光，透过一定厚度的试样溶液后，部分光被吸收，剩余的光照射到光电元件上，产生光电流，在仪器上读取相应的吸光度或透光率，完成测定工作。

一、紫外-可见分光光度计的基本构造

目前，紫外-可见分光光度计的种类、型号很多，但基本构造都相似，都主要由以下部件组成，如图2-3所示。

1.光源

光源的主要作用是提供符合要求的入射光。分光光度计对光源的要求是：在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射，有足够的辐射强度和良好的稳定性，使用寿命长。实际常用的光源一般分为紫外光光源和可见光光源。

（1）紫外光光源　紫外光光源多为气体放电光源，其中应用最多的是氢灯和氘灯，其使用波长范围为185～375nm。为了保证发光强度稳定，可配稳压器，以稳定电源供电。氘灯的光谱分布与氢灯相同，但光强比同功率的氢灯要大3～5倍，使用寿命比氢灯长。

近年来，具有高强度和高单色性的激光已被开发用作紫外光源。已商品化的激光光源有氩离子激光器和可调谐染料激光器。

（2）可见光光源　钨丝灯是最常见的可见光光源，它可发射出波长为325～2500nm范围的连续光谱，其中最适宜的使用范围是320～1000nm，除用作可见光源外，还可用作近红外光源。为了保证钨丝灯发光强度稳定，需要采用稳定电源供电，也可用12V直流电源供电。

目前，不少分光光度计已采用卤钨灯代替钨丝灯，如7230型、754型分光光度计等。所谓卤钨灯是在钨丝中加入适量的卤化物或卤素，灯泡用石英制成，具有较长的寿命和较高的发光效率。

2.单色器

单色器是一种将来自光源的复合光分解为单色光并能分离出所需要波长的装置，是分光光度计的心脏部分。它主要由入射狭缝、色散元件、准直镜和出射狭缝等部分组成，其中色散元件是关键部件。

入射狭缝的作用是限制杂散光进入；色散元件的作用是将复合光分解成单色光，常用的色散元件有棱镜和光栅。棱镜和光栅的色散原理是依据不同波长的光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开；准直镜的作用是将来自狭缝的光束转化为平行光，并将来自色散元件的平行光束聚焦在出射狭缝上；出射狭缝的作用是将额定波长范围的光射出单色器。

3.吸收池

吸收池又称比色皿，是用于盛放被测溶液并决定液层厚度的无色透明器皿。一般有石英和玻璃材料两种。石英吸收池适用于可见及紫外光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。

吸收池的规格有0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm等，其中以1.0cm吸收池最为常见，使用时根据具体需要进行选择。

4.检测系统

检测系统的作用是检测透过吸收池的透射光信号，并将光信号转变为电信号。目前用得较多的检测器是光电管和光电倍增管。其中光电倍增管是检测微弱光时最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电管要高200倍。

5.信号显示系统

信号显示系统的主要作用是放大信号并以适当的方式指示或记录下来。常用的信号指示装置由直流检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。新型紫外-可见分光光度计显示系统大多采用微型计算机，它既可用于仪器自动控制，实现自动分析，又可进行数据处理，记录样品的吸收曲线，大大提高了仪器的灵敏度和稳定性。

二、紫外-可见分光光度计的类型

紫外-可见分光光度计的类型很多。按其光学系统可分为单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计三种类型。

1.单光束分光光度计

单光束是指从光源发出的光，经单色器分光后得到一束平行单色光，从进入吸收池到最后照在检测器上，始终为一束光，如图2-4所示。常见的721、722、723、724、752、754、T6等型号分光光度计都属于单光束分光光度计。

单光束分光光度计的特点：

（1）仪器简单、价格较低廉；

（2）操作麻烦，任一波长的光均要用参比调T=100％后，再测样品；

（3）不能进行吸收光谱的自动扫描；

（4）光源不稳定性影响测量准确度。

2.双光束分光光度计

从光源中发出的光经单色器分光后被旋转扇面镜（切光器）分成两束强度相等的单色光，一束通过参比溶液，一束通过被测溶液。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为被测液的透射比，经对数交换将它转换为吸光度并作为波长的函数记录下来，如图2-5所示。国产710、730、760MC、760CRT以及日本岛津UV-210型号分光光度计都属于双光束分光光度计。

双光束分光光度计仪器的特点：

（1）测量方便，不需要更换吸收池；

（2）补偿了光源不稳定性的影响；

（3）实现了快速自动吸收光谱扫描；

（4）不能消除试液的背景干扰。

3.双波长分光光度计

由同一光源发出的光被分出两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长的单色光。利用切光器使两束光以一定的频率交替照射到同一吸收池，然后经过光电倍增管和电子控制系统，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值（图2-6）。国产WFZ800S、日本岛津UV-300、UV-365型等分光光度计都属于双波长分光光度计。

双波长分光光度计的特点：

（1）不需要参比溶液；

（2）可以消除背景吸收干扰，包括待测溶液与参比溶液组成的不同及吸收液厚度差异的影响，提高了测量的准确度；

（3）适合多组分混合物、浑浊试样的定量分析，可进行导数光谱分析等；

（4）价格昂贵。

三、紫外-可见分光光度计的基本操作

目前紫外-可见分光光度计型号繁多，虽然不同型号的仪器其操作方法略有不同（在使用前应仔细阅读仪器说明书），但仪器上主要旋钮和按键的功能基本类似。下面介绍两种较为常见的分光光度计：SP722E型可见分光光度计、T6型紫外-可见分光光度计。

1.SP722E型可见分光光度计

（1）仪器面板按钮介绍　SP722E型可见分光光度计仪器面板按钮名称如图2-7所示。

（2）控制面板按键介绍　控制面板按键说明见表2-2。

（3）仪器基本操作

①接通电源开关，打开样品室暗箱盖，预热20min后，再选择需用的入射单色光波长，按动“切换键”，切换到透射比（T）测定模式，将挡光体放入样品架，并拉动吸收池架拉杆使其进入光路，然后按下仪器的“0％T”按钮，完成仪器调零。取出挡光体，盖好样品室暗箱盖，按下仪器的“100％T”按钮。

②打开样品室盖，将盛有参比溶液和被测溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。

③将参比溶液推入光路中，按下仪器的“100％T”按钮。并按动“切换键”，切换到吸光度（A）测定模式。

④将被测溶液推入光路中，显示器上所显示的是被测样品的吸光度值。

⑤测量完毕，取出比色皿，洗净后倒置于滤纸上晾干，关闭电源，拔下电源插头，盖上仪器防尘罩，填写仪器使用记录。

注意：在测量过程中，每改变一次波长，都要对仪器进行校正。

2.T6型紫外-可见分光光度计基本操作

T6型紫外-可见分光光度计可选择的波长有紫外光和可见光。仪器外观如图2-8所示。

这里主要介绍T6型紫外-可见分光光度计的基本操作。

（1）开机自检　打开仪器主机电源，仪器开始初始化，约3min后仪器初始化完成。初始化完成后，仪器进入主菜单。

（2）进入光度测量状态　按ENTER键进入光度测量界面。

（3）进入样品测量界面　按START/STOP键进入样品测量界面。

（4）设置样品测量波长　按GOTO键，输入测量波长，按ENTER键确认，仪器将自动调整波长。

（5）进入参数设定界面　按SET键进入参数设定界面，按▼键使光标移动到“试样设定”，按ENTER键确认，进入到设定界面。

（6）设定使用样品池个数　按▼键使光标移动到“使用样池数”，按ENTER键循环选择需要使用的样品池数。

（7）样品测量　按ENTER键返回到参数设定界面，再按RETURN键返回到光度测量界面。在1号样品池内放入空白溶液，2号样品池内放入待测样品。关闭好样品池盖后按ZERO键进行空白校正，再按START/STOP键进行样品测量。

如需测量下一个样品，取出比色皿，更换为下一个测量的样品，按START/STOP键即可读数；如果需要更换波长，直接按GOTO键，调整波长；如果每次使用的比色皿个数固定，下一次使用时可跳过第（5）、（6）步骤直接进入样品测量。

注意：更换波长后必须重新按ZERO键进行空白校正。

（8）测量结束　测量完成后记录数据，退出程序或关闭仪器后测量数据将消失。确保已从样品池中取出所有比色皿，清洗干净后以便下一次使用。按RETURN键直接返回到仪器主菜单界面后再关闭仪器电源。

四、紫外-可见分光光度计的维护与保养

紫外-可见分光光度计是精密光学仪器。正确安装、使用和保养对保持仪器良好的性能和保证测试的准确度有重要作用。

（1）仪器工作电源一般允许220V±10％的电压波动。为保持光源灯和检测系统的稳定性，在电源电压波动较大的实验室，最好配备稳压器（有过电压保护）。

（2）为了延长光源使用寿命，在不使用时不要开光源灯。如果光源灯亮度明显减弱或不稳定，应及时更换新灯。更换后要调节好灯丝位置，不要用手直接接触窗口或灯泡，避免油污黏附，若不小心接触过，要用无水乙醇擦拭。

（3）单色器是仪器的核心部分，装在密封盒内，不能拆开，为防止色散元件受潮生霉，必须经常更换单色器盒中的干燥剂。

（4）必须正确使用吸收池，保护吸收池光学面。

（5）光电转换元件不能长时间曝光，应避免强光照射或受潮积尘。

思考与练习2.2

一、单选题

1.双波长分光光度计与单波长分光光度计的主要区别在于（　）。

A.光源的种类及个数

B.单色器的个数

C.吸收池的个数

D.检测器的个数

2.常用作光度计中获得单色光的组件是（　）。

A.光栅（或棱镜）+反射镜

B.光栅（或棱镜）+狭缝

C.光栅（或棱镜）+稳压器

D.光栅（或棱镜）+变压器

3.在紫外-可见分光光度法中，电源发出的光属于（　）。

A.复合光

B.单色光

C.杂光

D.可见光

4.在分光光度计中，能将复合光转化为单色光的装置是（　）。

A.光源

B.单色器

C.吸收池

D.检测器

5.下列关于吸收池说法错误的是（　）。

A.吸收池也称为比色皿，主要作用是盛装被测溶液

B.吸收池可分为石英比色皿和玻璃比色皿

C.在紫外光区，常用玻璃比色皿

D.吸收池在使用前要进行配套性实验

6.关于吸收池的操作，错误的是（　）。

A.拿取吸收池时，只能用手指接触两侧的毛玻璃，不可接触光学面

B.吸收池装被测溶液，尽量装满

C.洗涤时一般用自来水、蒸馏水洗涤干净

D.吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向

二、简答题

1.简述紫外-可见分光光度计的主要结构及各部件作用。

2.如何正确使用吸收池？

3.紫外-可见分光光度法的测定依据是什么？

学习心得

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