五、质控和标准

DNA-ICM大多采用或符合欧洲分析细胞病理学会（ESACP, European Society for Analytical Cellular Pathology）1994年在Grenoble第三次会议制定的DNA-ICM任务和标准。DNA-ICM质量控制和标准要符合以下几点：

（一）标本的准备和染色

1．样本：各种涂片、细针穿刺、组织印片、各种积液细胞制片、细胞培养单层片、用机械和酶方法从新鲜组织和石蜡包埋组织中分离的细胞制片方法。

2．固定：细胞载玻片，可用福尔马林固定；先将细胞片空气干燥1小时以上，然后再用4%多聚甲醛固定30min，再用蒸馏水清洗。原有染色的玻片，去掉盖玻片后，也可用这些方法固定。

3．染色：一般用Feulgen染色。酸化过程可根据细胞组织来源、制片方法和固定等情况不同而不同。染色时间应根据时间与IOD关系曲线来决定的（见第二章）。酸化和染色都应该控制在一定的温度和时间内。

通常染色过程在5N HCl，25℃下酸化1小时，然后用蒸馏水清洗停止酸化过程，再染色1小时。染色时要确保载玻片上的细胞在染液中。染色后用Sulfite溶液洗掉细胞核和细胞浆上多余的染料。

Feulgen染色通常用Pararosaniline（副品红）和Thionin（劳氏紫）。Pararosaniline多为红色，最大吸收光波长为560nm。Thionin为深蓝色，最大吸收光波长为590nm。配制好的Pararosaniline染液可保存1年，而Thionin染液仅可保存2周。Feulgen染色的质控可用没有酸化细胞载玻片做为对照，经Feulgen染色后不应有颜色反应。

（二）DNA-ICM用于测定DNA含量时的要求

建立系统：

1．对蓝光（如劳氏紫，590±10nm）或红光（如副品红，560±10nm）使用不同的滤光片；

2．柯勒照明；

3．模数转换器；

系统质量保证：

1．随时检查稳定性；

2．检查密度计的一致性（用特定的转换玻璃组）；

3．检查阴影现象；

4．检查杂散光现象。

（三）密度计的测量

1．在聚焦的过程中测量细胞核，在自动系统中，测量后检查图像框；

2．在测量过程中请勿调整硬件（如柯勒照明系统，模数转换器）；

3．通过软件程序来矫正阴影；

4．通过软件程序矫正每个细胞的局部背景；

5．通过软件矫正杂散光；

6．用视频控制实现测量后的人工复合和细胞分类；

7．检查IOD值（2c、4c、8c）的一致性。例如，使用小脑细胞或者鼠肝细胞。

（四）质控细胞

1．质控细胞在DNA-ICM测定细胞DNA含量时是必需有的。

2．内外对照细胞

（1）内对照细胞片：一般将同一样品内的淋巴细胞或粒细胞核作为对照组，也可将样品内一些正常上皮细胞作为对照，比较被测细胞的DNA含量，作为细胞分类的标准。

（2）外对照细胞片：可用正常大鼠肝脏印片细胞作为外对照，比较每次扫描结果，可控制染色和DNA-ICM的质量。

3．对照细胞的准备和固定应与被测细胞相似。

4．对照细胞应与被测细胞一起染色。

5．对照细胞应与被测细胞同时或相近时间内被DNA-ICM测定。

6．对照细胞片内的细胞间IOD的CV不应超过6%。

（五）DNA-ICM的c刻度的确定

1．用对照细胞光吸收单位来确定c刻度单位（2c、4c、8c等）；

2．估计对照细胞和被测二倍体细胞的差别，并做出这种差别的标准差。

（六）运用标准

1．相同的二倍体细胞在30个视野下，IOD的CV应≤3%；

2．G1/G0期二倍体细胞群（n=30，例如淋巴细胞），在30个视野下，IOD的CV应＜5%；

3．三种不同形态的细胞核IOD平均值差别不应＞5%。

（七）DNA含量的直方图可用于诊断和预测肿瘤

经DNA-ICM测定后出现的DNA含量直方图应该可用于如下：

1．肿瘤的诊断；

2．肿瘤的预测；

3．肿瘤恶性度的评估；

4．对制定肿瘤治疗计划有帮助。