上篇 人参营养成分及功能因子分析方法
1 人参中氨基酸分析方法
人参中富含多种氨基酸，多数为人体必需氨基酸，氨基酸含量已作为衡量人参产品质量的指标之一。目前对于人参中氨基酸的测定，多采用氨基酸自动测定仪、衍生化反相高效液相色谱法等。前者存在仪器复杂、体积大、费用高等不足，后者需要对衍生化试剂、衍生化反应条件及产物的稳定性等进行相应的考察，不利于直接、快速地测定氨基酸。本书首次采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）对人参中氨基酸进行了直接测定。
1.1 材料与仪器
1.1.1 人参
鲜人参采自我国吉林省、黑龙江省、辽宁省及朝鲜、韩国各人参主要产区，详见附录。
1.1.2 仪器
岛津LC-10AT液相色谱仪（日本岛津公司），岛津CBM-102色谱工作站（日本岛津公司），法国SEDERE SEDEX 75型蒸发光检测器（法国SEDERE公司），AT-330色谱柱恒温箱（天津奥特赛恩斯仪器有限公司），R201D型恒温水浴锅（上海豫康科教仪器设备有限公司），FA1104N型电子分析天平（上海菁华科技仪器有限公司），FW177型高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司），RCT-3200型超纯水系统（长春莱博帕特科技发展有限公司），GZX-9076 MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），高纯度氮气。
1.1.3 试剂
乙腈（色谱纯，美国Fisher公司），甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），水为超纯水，三氟乙酸（TFA）（纯度＞99.5%，西亚试剂公司），七氟丁酸（纯度＞98%，阿拉丁试剂公司），其他试剂均为分析纯。24种氨基酸对照品：丙氨酸（Ala），2-氨基丁酸（2-aminobutyric acid），精氨酸（Arg），天冬氨酸（Asp），半胱氨酸（Cys），胱氨酸（Cys-Cys），DL-3-（3,4-二羟苯基）丙氨酸（DL-3,4-DOPA），谷氨酸（Glu），甘氨酸（Gly），组氨酸（His），L-羟脯氨酸（L-hydroxyproline），亮氨酸（Leu），异亮氨酸（Ile），正亮氨酸（Nle），赖氨酸（Lys），蛋氨酸（Met），鸟氨酸（Orn），苯丙氨酸（Phe），脯氨酸（Pro），丝氨酸（Ser），苏氨酸（Thr），色氨酸（Try），酪氨酸（Tyr），缬氨酸（Val）（纯度＞99.0%，英国BDH公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 对照品混合溶液和供试品溶液的制备
1.2.1.1 对照品混合溶液的制备
分别精密称取组氨酸等23种氨基酸对照品（除胱氨酸）适量，置于同一量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶解配制成各氨基酸浓度均约为1.0g/L的对照品混合溶液Ⅰ，精密称取胱氨酸对照品适量置于另一量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶解以超纯水定容，配制成胱氨酸浓度约为1.0g/L的对照品溶液Ⅱ，两者用前等份混合制备成浓度为0.5g/L的24种氨基酸混合对照品溶液A，备用。取天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸、谷氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸适量置于同一量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶解配制成各氨基酸浓度均约为1.0g/L的对照品混合溶液Ⅲ，取等份Ⅱ和Ⅲ混合制成0.5g/L的混合对照品溶液B，备用。
1.2.1.2 供试品溶液的制备
称取过100目筛人参样品粉末0.1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入6mol/L盐酸20mL，充氮气密封，恒温110℃水解24h，放冷，滤过，挥干滤液，用超纯水转移定容至5mL容量瓶，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，备用。
1.2.2 色谱条件
SpursilTM C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）。混合对照品溶液A，流动相A为乙腈∶甲醇=1∶1，流动相B为0.03%三氟乙酸溶液（含5mmol/L七氟丁酸）。线性梯度洗脱程序：0～15min 0%流动相A，30min时升至15%流动相A，保持15%流动相A至50min，55min时升至35%流动相A，保持至65min，66min回到0%流动相A，保持至76min。洗脱条件：流速0.6mL/min，柱温25℃，漂移管温度40℃，氮气流量2.9L/min，进样量20μL。混合对照品溶液B，流动相为0.5%三氟乙酸溶液（含5mmol/L七氟丁酸）；流速0.5mL/min，柱温25℃，漂移管温度40℃，氮气流量2.9L/min，进样量15μL。
1.2.3 总氨基酸含量测定方法
1.2.3.1 标准曲线的绘制
精密吸取混合对照品溶液A 4μL、6μL、8μL、10μL、12μL、14μL、16μL，在上述色谱条件下线性洗脱程序进高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD），精密吸取混合对照品溶液B 1μL、2.5μL、3.5μL、5μL、6μL、7.5μL、9μL，以上述色谱条件下等度洗脱条件进HPLC-ELSD。以各氨基酸进样质量（μg）的自然对数x为横坐标，以各种氨基酸峰面积的自然对数y为纵坐标进行线性回归，所得各氨基酸的线性回归方程见表1.1。
表1.1 24种氨基酸的线性回归方程和相关系数
Tab 1.1 Regression equations with correlation coefficients（R）of twenty-four amino acids
y—峰面积的自然对数；x—质量的自然对数（μg）。
y—natural logarithm of peak area; x—natural logarithm of mass （μg）。
混合对照品溶液A的HPLC-ELSD谱图，见图1.1；混合对照品溶液B的HPLC-ELSD谱图，见图1.2。
图1.1 混合对照品溶液A的HPLC-ELSD谱图
Fig 1.1 HPLC-ELSD chromatogram of Mixed Standard Solution A
10—Cys-Cys；11—Pro；12—2-氨基丁酸；13—Lys；14—His；15—Val；16—DL-3,4-DOPA；17—Arg；18—Met；19—Tyr；20—Ile；21—Leu；22—Nle；23—Phe；24—Trp
图1.2 混合对照品溶液B的HPLC-ELSD谱图
Fig 1.2 HPLC-ELSD chromatogram of Mixed Standard Solution B
1—Gly；2—Ser；3—Asp；4—羟脯氨酸；5—Ala；6—Thr；7—Orn；8—Glu；9—Cys；10—Cys-Cys
1.2.3.2 供试品溶液的总氨基酸含量测定及结果
在上述条件下，取各人参样品按供试品溶液制备方法制备后进HPLC-ELSD后测定，图谱见图1.3、图1.4。
图1.3 样品汪清6年人参中氨基酸HPLC-ELSD图谱
Fig 1.3 HPLC-ELSD chromatogram of amino acids from Wangqing sexennial Panax ginseng
图1.4 宽甸5年人参中氨基酸HPLC-ELSD图谱
Fig 1.4 HPLC-ELSD chromatogram of amino acids from Kuandian quinquennium Panax ginseng