2.2　芽孢杆菌鉴定方法

芽孢杆菌的鉴定十分重要，只有准确的鉴定才能正确的分类和掌握特性，并更好地使产品得到推广应用。芽孢杆菌在自然界普遍存在，由于能够产生抗性的芽孢，比较容易从自然界分离到。通常在采集到样品后，首先制成悬浊液，然后采用加热沸腾的方法，杀灭芽孢杆菌营养体和其他微生物细胞保留耐热的芽孢，分离可采用涂布或直接划线进行，随后可进行镜检观察外形。

2.2.1　菌体与菌落形态特征描述

形态特征包括菌体形态特征描述和细菌群体菌落形态特征描述。菌体形态描述包括革兰氏染色、菌体大小的测量、鞭毛染色、运动性观察、芽孢形状与着生位置、荚膜、细胞壁、异染粒、伴胞晶体、抗酸染色等。观察方法有光学显微镜观察、透射电子显微镜观察、扫描电镜观察和超薄切片观察法等。群体菌落形态特征以菌落颜色、质地、含水量、有无皱褶和菌落边缘形状为主。

不同芽孢杆菌的个体形态有差异，具体表现在它们的细胞形状、大小及含有的某些特殊结构等方面。由于芽孢杆菌的细胞细小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，故必须对它们进行染色后观察。染色方法较多，确定测试菌的革兰氏染色反应的特征，一般可采用18～24h的菌龄染色。对某些不太稳定的菌株要多次重复加以判别。染色时最好用已知菌株做阳性（如枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）和阴性（如大肠杆菌）对照。

芽孢观察采用孔雀绿染色法，用以确定测试菌芽孢的形状、芽孢在胞囊中的着生位置及胞囊是否膨大等。有时可采用结晶紫单染色法或革兰氏染色，这时菌体易着色而芽孢不易着色，因此能观察到不着色的芽孢，但要注意区别不着色的芽孢和细胞内的不着色颗粒状多聚体，如巨大芽孢杆菌能产生大量的不着色的聚β-羟基丁酸。在实际工作中，有些芽孢杆菌的成熟芽孢不是立即与胞囊脱离，所以可以用革兰氏染色直接判断有无芽孢产生，因为成熟的芽孢不被着色，而菌体细胞被染成紫色。

菌体大小以μm为单位，测量选用对数期后期快速生长即将结束的细胞，一般是培养18～24h的细胞，通常每个菌株测量10个未形成芽孢菌体的宽度和长度。菌体大小在菌种的初步鉴定中具有较重要的意义。如菌体宽度大于1μm的主要有炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、苛求芽孢杆菌等，其余菌体宽度正常情况下小于1μm。

鞭毛染色多数采用银染法，确定测试菌有无鞭毛及鞭毛着生的位置和形式。半固体穿刺培养也是判断细菌有无运动性、是否有鞭毛的主要方法。

菌落特征也是芽孢杆菌初步鉴定的一个重要指标，不同种的芽孢杆菌，在相同成分或状态的培养基上的群体生长特征有差异。菌落形态观察采用24h平板培养菌株，主要观察记录单菌落的形状、菌落表面特征、菌落边缘形状、菌落的光学特性以及菌落的颜色和是否分泌可溶性色素等。有些芽孢杆菌在一定的培养条件下常能形成特殊形态的菌落，如能在肉汤琼脂培养基上形成假根状菌落，即为蕈状芽孢杆菌；芽孢侧生在胞囊中，则为侧胞芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的形态和生理特征很相似，可通过厌氧生长加以区别；炭疽芽孢杆菌是本属中唯一哺乳动物致病菌，其菌落边缘在低倍显微镜下观察呈典型卷发状，细胞两端平齐，呈链状排列；嗜热脂肪芽孢杆菌和酸热芽孢杆菌都具有耐高温特点，但两者可根据在pH6.8肉汤液中生长的特点而加以区别。

2.2.2　芽孢杆菌形态结构

芽孢杆菌通常是革兰氏阳性细菌，多呈杆状或短杆状，大小在0.5～10μm之间。在适宜的生长条件下，幼龄细胞或对数期细胞的形态一般较为稳定，适宜进行形态特征的描述，到了生长后期会产生一个具有抗逆性的芽孢，个别菌种还会产生伴胞晶体，由此共同构成芽孢杆菌的一个完整生活周期。在特殊环境条件下，有些菌株的大小和形态会受环境条件，如培养基成分、浓度、培养温度和时间等的影响，菌体表现出膨大、分枝或丝状等畸形。由于芽孢杆菌个体微小，阐述芽孢杆菌的形态从群体形态和个体形态两个方面展开。

（1）芽孢杆菌群体形态

芽孢杆菌在一定的培养基上生长时，由于菌体分裂方式不同，是否运动及运动方式的不同，会产生菌落表面形态的差异，从而构成不同的菌落群体特征，如图2-1所示。

芽孢杆菌主要以二分裂的方式进行繁殖。分裂时，核区DNA首先复制为两条DNA双螺旋链，然后形成两个核区。接着在两个核区间产生新的细胞膜与细胞壁，将细胞分隔为两个，各含一条与亲代相同的核DNA。每次经过这样一个过程为一个世代，每个过程所经历的时间成为一个代时。适宜条件下，菌种不同，代时会有所不同。例如枯草芽孢杆菌的代时为26～32min，蜡状芽孢杆菌的代时为18min，蕈状芽孢杆菌的代时为28min。

芽孢杆菌多数有鞭毛，能够运动，菌落边缘常呈波形、齿状等不规则形状，细胞分裂后常呈链状排列，因此菌落表面粗糙，有环状或放射状的皱褶。由于芽孢杆菌生长的后期产生芽孢，因而芽孢杆菌菌落因折光率的变化使菌落变得不透明或有干燥的感觉。例如，枯草芽孢杆菌由于鞭毛侧生，能运动，菌落边缘不规则，表面形成皱褶；地衣芽孢杆菌菌落边缘常形成毛发状，且和培养基结合紧密；蜡状芽孢杆菌菌落的表面不透明，呈毛玻璃状；多黏芽孢杆菌的菌落薄而延展，常呈阿米巴状扩展；巨大芽孢杆菌菌落通常不扩展；环状芽孢杆菌和蜂房芽孢杆菌的菌落由于菌落快速扩展而形成“运动的菌落”；蕈状芽孢杆菌菌落呈树根状，不同菌株可呈现顺时针弯曲或逆时针弯曲。

加0.5％～1％琼脂制成的半固体培养基，常用于穿刺接种，用来观察芽孢杆菌的运动情况。如果芽孢杆菌只沿穿刺接种部位生长，为不运动细菌；能运动的细菌则向穿刺线四周扩散生长。

如果把芽孢杆菌在液体培养基中培养1～3d，液面可以形成膜、环等，通过观察培养液的浑浊程度、沉淀形态、有无气泡来判断菌株的一些生理特性。

（2）芽孢杆菌细胞结构

芽孢杆菌均为单细胞个体，在快速分裂时可以暂时形成链状，细菌的细胞结构通常可以分为两部分：基本结构和特殊结构。其中基本结构指一般细菌都有的结构，包括细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核等；特殊结构指只有某些细菌所具有的结构，包括芽孢、鞭毛和荚膜等。

①胞壁（cell wall）

细胞壁位于细胞最外层，由于芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，因此细胞壁的主要成分是肽聚糖和胞壁酸（图2-2）。

肽聚糖（peptideglycan）单体由三部分组成：双糖单位、短肽尾和肽桥。双糖单位由1分子N-乙酰葡萄糖胺与1分子N-乙酰胞壁酸分子通过β-1，4-糖苷键连接而成。短肽尾是由4个氨基酸相连接形成的短肽链，连接在双糖单位的N-乙酰胞壁酸分子上，这4个氨基酸通常是按L型与D型交替排列的方式连接而成的。双糖单位相互连接，构成糖链，两条糖链上相对应的短肽尾相互连接，构成肽桥。肽桥通常是指一条糖链短肽尾的第3个氨基酸和另一条糖链短肽尾的第4个氨基酸相互连接（图2-3）。

革兰氏阳性细菌的肽聚糖结构是呈现多样性的，这个多样性首先表现在短肽尾和肽桥的多样性上。首先，短肽尾上第3个氨基酸可以是L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-二氨基庚二酸或内消旋二氨基庚二酸（m-DAP），由此构成肽尾的多样性。其次是肽桥的多样性，两条链上的短肽尾可以直接交联，没有肽桥，例如枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等菌株，但大多数革兰氏阳性菌具有肽桥。有的肽桥只有一个氨基酸，有的由几个氨基酸构成短肽。第3位氨基酸多样性连同其肽桥的差异构成了芽孢杆菌肽聚糖的不同类型，这在芽孢杆菌的化学分类上具有重要意义。

糖链的长度因菌种而异，地衣芽孢杆菌的糖链由79个双糖单位构成，而金黄色葡萄球菌只有9个双糖单位。糖链之间通过肽桥相互连接，构成网格状结构，芽孢杆菌的细胞壁是由多层这样的网格结构叠加而成的。

磷壁酸（teichoic acid）是革兰氏阳性菌细胞壁所特有的成分。按照功能和结合部位的不同磷壁酸分为两种类型。其一为壁磷壁酸，它与肽聚糖分子间发生共价结合，可用稀酸或稀碱进行提取，其含量有时可达壁重的50％，含量多少与培养基成分密切相关；其二为膜磷壁酸（即脂磷壁酸），由甘油磷酸链分子与细胞膜上的磷脂进行共价结合形成，它的含量与培养条件关系不大，可用45％热酚水提取，也可用热水从脱脂的冻干细菌中提取。

磷壁酸在细胞新陈代谢中有着非常重要的功能。首先，因为它带有负电荷，可与环境中的Mg2+等阳离子结合，提高这些离子的浓度，保证细胞膜上一些合成酶的高活性；其次，可以保证某些致病菌与其宿主间的粘连；还可以赋予革兰氏阳性菌特异的表面抗原；或作为某些噬菌体特异的吸附受体。

当枯草芽孢杆菌生长在限量磷酸盐的培养基中时，往往不能合成磷壁酸，而代之以壁醛酸（葡萄糖醛酸-N-乙酰氨基半乳糖）。在许多古细菌和真细菌中还有一层表面结构，称为表面层（surface layers）或称为S层（S-layers），是由蛋白质组成的晶格状结构，位于细胞壁或细胞膜外层，是生物进化过程中最简单的一种生物膜。

S层是由蛋白质亚单位组成的单分子晶状结构，其厚度为5～20nm，在古细菌中可达70nm，比细胞膜略厚7～8nm，比G+细菌的细胞壁略薄20～80nm。其外表面相对较平滑，而内表面则相对比较粗糙。在芽孢杆菌中S层可作为胞外酶的吸附位点，如胞外淀粉酶可在S层上紧密排列，而不干扰营养物质或代谢产物穿过S层的网格。炭疽芽孢杆菌的S层由一层单分子蛋白质非共价结合而成鞘样包裹于细胞表面，它主要含有两种成分：EAl和Sap两种蛋白。

分子筛是S层的重要功能之一，由于S层孔洞的大小和形状均匀一致，可起到精细分子筛的作用。对于只利用小分子气体和盐类的细菌以及产生大量的胞外酶的芽孢杆菌，其S层只允许相应大小的分子通过。

②细胞膜（cell membrane）

细胞膜又称细胞质膜或质膜，是紧贴在细胞壁内侧的一层由磷脂和蛋白质组成的柔软而富有弹性的半透性薄膜。在电子显微镜下细胞膜呈明显的双层结构，在上下两暗色层间夹着一浅色的中间层。这是由于细胞膜是由两层磷脂分子整齐地排列而成。每一磷脂分子由一个带正电荷且能溶于水的极性头（磷酸端）和一个不带电荷和不溶于水的非极性尾（烃端）所构成。极性头朝向膜的内外两个表面，呈亲水性；而非极性的疏水尾则埋藏在膜的内层，从而形成一个磷脂双分子层。磷脂双分子层通常呈液态。不同的内嵌蛋白和外周蛋白可在磷脂双分子层液体中作侧向运动，这就是在1972年由Singer和Nicolson提出的细胞膜液态镶嵌模型。

细胞膜的功能是控制细胞内外物质的运送与交换。它是维持细胞内正常渗透压的屏障，是许多酶和电子传递链的存在部位，还是氧化磷酸化或光合磷酸化的产能基地和合成细胞壁各种组分和荚膜等大分子的场所，同时为鞭毛提供着生点和运动所需的能量。

在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等芽孢杆菌中还发现有间体（mesosome）存在，它是由细胞膜内褶形成的一种管状、层状或囊状结构，一般位于细胞分裂部位或其邻近，可能与细胞壁的形成、细胞分裂以及细胞呼吸时能量的传递有关。

③细胞质（cytoplasm）

细胞质是细胞膜内所含的无色透明黏稠的胶状物质，主要由水、蛋白质、核酸、脂类、糖、无机盐等内含物构成，核糖体和一些颗粒状结构也存在其中。

核糖体（ribosome）是细菌蛋白质合成的场所，由RNA和蛋白质构成，呈颗粒状，常以游离态分散于细菌细胞质中，数量可达上万个。核糖体中的RNA一般占到核糖体总重量的65％，其余是蛋白质。原核生物核糖体的沉降系数为70S，当环境中Mg2+浓度小于lmmol/L时可解离为30S和50S两个亚基；大于2mmol/L时又能重新结合；大于20mmol/L时还可形成二聚体。这两个亚基还可以进一步分离为5S、16S和23S三种rRNA和52个蛋白质亚基。

糖原（glycogen）和淀粉（starch）是细菌细胞内主要的碳源和能源。与碘液作用时，糖原呈红褐色而淀粉呈蓝色。肠道细菌常积累糖原，而多数细菌以淀粉为贮存物质。当培养环境中碳氮比高时，会促进碳素养料颗粒体的累积。

聚β-羟基丁酸（poly-β-hydroxybutyric acid，PHB）是细菌特有的一种与类脂相似的碳源和能源贮存物质。PHB易被脂溶性染料（如苏丹黑）着色而不易被普通碱性染料染色。PHB于1929年被发现，至今已发现60属以上的细菌能合成并贮藏该物质。由于它无毒、可塑、易降解，故认为是生产医用塑料、生物降解塑料的良好原料。若干产碱菌、固氮菌、假单胞菌和巨大芽孢杆菌是主要的生产菌种。当巨大芽孢杆菌在含有乙酸或丁酸的培养基中生长时，细胞内储存的PHB可达到细胞干重的60％。

淀粉、糖原、PHB等颗粒性贮藏物质的形成能防止细胞内渗透压或酸度过高，当环境养料缺乏时又可被分解利用。

④细胞核（nucleus）

原核生物没有明显的细胞核，它们的核物质没有特定的形态和结构，也不为核膜所包裹，仅较集中地分布在细胞质的特定区域内，称为原核或拟核。电镜超薄切片显示，原核区域的电子密度较低并呈现出丝状结构。原核区多呈球形、棒状或哑铃状，在正常情况下一个细胞只含有一个原核。当旺盛生长时，由于DNA复制提前，也可以在一个细胞内发现多个原核。细胞核包含的遗传物质主要有细菌染色体和质粒。

细菌染色体与真核细胞不同，染色体不与组蛋白结合，DNA约占60％，RNA为30％，其余10％是蛋白质。原核在电镜下实质上是一条紧密而有规律缠绕的环状双链DNA丝。细菌染色体携带了细菌绝大多数的遗传信息。它是细菌生长发育、新陈代谢和遗传变异的控制中心。

质粒（plasmid）是细菌染色体以外的遗传物质，能独立复制，也是共价闭合环状双链DNA。但质粒的分子量比染色体小得多，通常是细菌染色体大小的1％～2％，大小在1×106～1×108Da，含有几个到上百个基因。质粒不仅对微生物本身具有重要意义，而且在遗传工程研究中是外源基因的重要载体，许多天然或经人工改造的质粒已成为基因克隆、转化、转移及表达的重要工具。

⑤芽孢（spore）

芽孢杆菌在其生长发育后期，可在细胞内形成壁厚、质浓、折光性强并抗不良环境条件的休眠体，称为芽孢（图2-4）。由于每一细胞仅形成一个芽孢，故形成芽孢是个体进入休眠状态而不是一个繁殖过程。芽孢在营养体中的位置有中生、端生和次端生，多数营养体细胞在形成芽孢时是不膨大的，少数膨大。

芽孢无任何代谢活力。一般的芽孢在普通条件下可保存几年至几十年的活力。从德国的一个植物标本上分离到保存了200～300年的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，而凝结芽孢杆菌和环状芽孢杆菌的芽孢也可保存50～100年之久。有些湖底沉积土中的芽孢杆菌芽孢经500～1000年后仍有活力。巨大芽孢杆菌芽孢的抗辐射能力要比E.coli的营养细胞强36倍。芽孢在营养物质和环境条件适宜时开始萌发和繁殖，一旦营养物质耗尽则又会形成新的芽孢。

电子显微镜观察表明，芽孢的结构相当复杂。芽孢外覆盖由蛋白质、脂类等组成的外壳，称为胞外壁（exosporium）。胞外壁内侧是由多层蛋白组成的芽孢衣（spore coat），它非常致密，无透性，负责芽孢对化学物质的抗性。位于芽孢衣内侧的皮层（cortex）几乎占芽孢体积的一半，主要由芽孢肽聚糖组成，其交联度比营养细胞中的肽聚糖低。中心是芽孢核心（spore core），由芽孢壁、芽孢膜、芽孢质和核区组成。

胞外壁位于芽孢最外层，透性差，是母细胞的残留物，分内外两层（外层厚约6nm，内层厚约19nm），主要成分是脂蛋白，也含少量氨基糖。通常各主要成分所占的比例为蛋白质52％、糖类20％、脂质12.5％、磷酸5.5％和灰分3.8％。胞外壁可有可无，或松或紧，重量占芽孢干重的2％～10％。胞外壁外还有一个母细胞的空壳，称为芽孢囊（sporangium）。

芽孢衣是构成芽孢的主要成分，主要由蛋白质组成，其蛋白质大约可占到整个芽孢蛋白质的50％，厚度约3nm，层次很多（3～15层），主要含疏水性的角蛋白，占芽孢衣总蛋白的50％～80％。芽孢衣对溶菌酶、蛋白酶和表面活性剂具有很强的抗性，对多价阳离子的透性很差。芽孢衣的蛋白质结构和性质既不同于一般的细胞蛋白质，也不同于角质蛋白，只是在一定程度上表现出角质化。不同菌种形成的芽孢衣，多肽数目差别很大，从蜡状芽孢杆菌的仅以1种为主到枯草芽孢杆菌中达到25种之多。在电镜下观察，枯草芽孢杆菌所形成的芽孢衣分为3层：不定型的底层、片状的内层及密电子具壳纹的外层。

皮层在芽孢中占有很大体积（36％～60％），内含大量为芽孢皮层所特有的芽孢肽聚糖。其特点是纤维束状、交联度小、负电荷强、可被溶菌酶水解。还含有占芽孢干重7％～10％的DPA-Ca（吡啶二羧酸钙盐），这是芽孢所特有的，不含磷壁酸。皮层的耐渗透压能力强，可高达20个大气压左右，含水量约70％，略低于营养细胞（约80％），而比芽孢的平均含水量（40％左右）高出许多。芽孢肽聚糖与组成营养细胞细胞壁的肽聚糖组分和结构大不相同，它是由丙氨酸亚单位、四肽亚单位和胞壁酸内酰胺亚单位构成，在四肽亚单位中，只有20％的短肽横向联系，因此皮层肽聚糖结构比较疏松。芽孢的皮层在芽孢萌发过程中会逐渐被分解。

芽孢核心由芽孢壁、芽孢膜、芽孢质和核区四部分构成，含水量极低。除芽孢膜中不含磷壁酸和芽孢质中含DPA-Ca外，核心中的其他成分与一般营养细胞相似。芽孢壁（spore cell wall）位于芽孢皮层内侧，与营养细胞的细胞壁结构相同，主要成分为肽聚糖，在芽孢萌发时成为营养细胞的细胞壁。原生质体（protoplast）是由芽孢膜包裹的原生质部分。芽孢的原生质体与营养细胞的原生质体相比有很大的差别。首先芽孢原生质体的含水量很低，仅有营养细胞含水量的38％，但钙、镁、磷、锰等无机离子的含量相对很高，从而使原生质体中的自由水含量很低，限制了许多生物化学反应的进行；其次，虽然芽孢的酶系统与营养细胞的酶系统相似，但酶活性大大降低，例如，在某些芽孢杆菌的原生质体中，呼吸系统的氧化还原酶的活性极低，仅有一些NADH氧化酶呈现活性，这就决定了芽孢的呼吸作用极微，降低了芽孢的能量消耗；第三，芽孢的原生质体中含有独特的吡啶二羧酸（DPA），这些DPA与钙形成稳定的螯合物，增加芽孢的抗性。

少数芽孢杆菌，例如苏云金芽孢杆菌、球形芽孢杆菌等在形成芽孢的同时，还会形成一种蛋白质结晶体，称为伴胞晶体。它的干重可达芽孢囊重量的30％左右，由18种氨基酸组成，大小约0.6mm×2.0mm。由于伴胞晶体对200多种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫有毒杀作用，因此苏云金芽孢杆菌、球形芽孢杆菌是很好的昆虫病原菌，可以制成细菌杀虫剂。

⑥糖被（glycocalyx）

有些芽孢杆菌，如多黏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌等的细胞壁外存在着一层厚度不定的胶状物质，称为糖被。其主要成分为多糖、多肽或蛋白质。根据其厚度的不同，常有不同的名称，例如微荚膜（microcapsule）、荚膜（capsule）或黏液层（slime layer）。荚膜可通过离心沉降与菌体分开。黏液层是能扩散到培养基中的胞外多糖，通过离心无法使它沉降，有时甚至将培养容器倒置时，培养液还是结成凝胶状。用碳素墨水进行负染色或用荚膜染色法染色，可在光学显微镜下清楚地观察到细菌的荚膜。荚膜可以保护细菌免受干旱损伤，保护自身免受宿主白细胞的吞噬，贮藏养料，堆积某些代谢废物，通过荚膜或其有关构造可使菌体附着于适当的物体表面。

⑦鞭毛（flagellum）

某些细菌体表生长的长丝状、波曲的附属物，称为鞭毛，其数目为1～10根，鞭毛具有运动功能。芽孢杆菌多数有鞭毛，可以运动鞭毛的直径通常有0.01～0.02μm，可用电子显微镜直接观察；若经过染料加粗后在光学显微镜下也可清楚地观察到。在暗视野显微镜下，观察水浸片或悬滴标本中细菌的运动情况判断鞭毛的有无及着生位置和数量；在半固体培养基中用穿刺接种法接种培养后，如果在其穿刺线周围有向外扩展的生长线，说明该菌具有运动能力，即可推测其存在着鞭毛；如果平板培养基上的菌落形状大而薄，边缘极不规则，说明该菌具有运动能力。有鞭毛的芽孢杆菌大多数为周生鞭毛。例如枯草芽孢杆菌是周生鞭毛，每秒钟能移动7μm。某些芽孢杆菌，如环状芽孢杆菌能借助鞭毛的定向排列和协调运动，使整个菌落在固体培养基表面成团转移，构成运动的菌落。

2.2.3　芽孢杆菌生理生化特征分析

芽孢杆菌个体微小，形态特征简单，单凭形态学特征难以达到正确鉴定的目的。但是，不同种的芽孢杆菌所具有的酶系常有差异，因而生理特征也是菌种鉴定的重要依据。细菌生理特征主要包括生长温度和耐热性检验、酶系特征分析、细胞壁的化学组成分析、醌类分析等。

过氧化氢酶又称接触酶，是需氧芽孢杆菌的典型特征。能催化过氧化氢分解成氧和水。采用5％过氧化氢和培养物在载玻片上混合，有气泡形成即表明菌株产生过氧化氢酶。需氧芽孢杆菌的过氧化氢酶均为阳性。在这一实验操作中一定要注意清洗载玻片，不洁净的载玻片会导致假阳性结果。

不同的芽孢杆菌对氧气的需求常有差异，即有好氧菌和兼性厌氧菌。我们采用厌氧培养基验证芽孢杆菌在厌氧条件下的生长情况。在制作培养基时加入还原剂，如巯基醋酸钠和甲醛次硫酸钠等，除去培养基中的氧气或氧化性物质制成缺氧培养基。常用缺氧培养基的配方为酪素水解物20g，葡萄糖10g，NaCl 5g，巯基醋酸钠（HSCH2COONa）2g，甲醛次硫酸钠（HOCH2SO2Na）1g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，调节pH7.2。穿刺接种到培养基底部，30℃培养3～7d，若芽孢杆菌在琼脂培养基表面生长为好氧菌，沿穿刺线生长为厌氧菌或兼性厌氧菌。

乙酰甲基甲醇实验（Voges-Proskauer test或V-P实验）是测定芽孢杆菌发酵葡萄糖产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物乙酰甲基甲醇的实验。反应原理是乙酰甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸所含胍基起作用，生成红色化合物，即表示V-P实验阳性。若在培养基中加少量肌酸补充胍基可加速反应。测试方法是细菌培养基30℃培养4d后，取培养液2mL和等量40％NaOH相混合，充分震荡2～5min，培养液呈红色即表示V-P实验阳性。有时需放置更长时间才出现红色。在培养7d后用精密pH试纸测pH值。

芽孢杆菌能利用不同种类的碳水化合物并产酸。一般采用无机氮培养基了解葡萄糖的产酸能力。培养基配方如下：MgSO4·7H2O 0.2g，（NH4）2HPO40.2g，KClO42g，酵母膏0.2g，碳水化合物（葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇）10g，蒸馏水1000mL，调节pH7.0，后加溴甲酚紫作为指示剂，采用18～24h菌种穿刺接种，30℃培养7～14d观察，指示剂由紫色变黄，表示糖类发酵产酸，葡萄糖琼脂柱中有气泡出现表示产气。由于芽孢杆菌分解蛋白质的能力很强，如果在有有机氮的情况下，可使培养基释放出的氨完全中和从碳水化合物产生的酸，从而造成假阴性。

能否利用柠檬酸盐是鉴别某些芽孢杆菌的重要方法。以磷酸铵作为氮源，能利用柠檬酸钠作为碳源生长并产生CO2，钠离子的存在可使培养基呈碱性。30℃培养3～7d指示剂蓝色或桃红色为阳性（变碱），说明芽孢杆菌能够产生分解柠檬酸钠的酶。

牛奶中的主要成分为乳糖和酪素，多数芽孢杆菌能产生蛋白酶，分解酪素。将50mL脱脂牛奶放入一只三角瓶中，另取1.5g琼脂加入到50mL蒸馏水中，分别115℃，30min灭菌，冷却至45～50℃混匀倒平板。采用三点接种方式，30℃培养1～14d，菌落周围或下面呈现透明，表明酪素已被分解，透明圈的大小与芽孢杆菌产酶能力呈正相关。

芽孢菌产生的淀粉酶可将淀粉水解成无色糊精，甚至形成麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不会变蓝。采用淀粉培养基两点接种，30℃培养2～4d。平板上滴加碘液，菌落周围有透明圈的为阳性，其大小说明解淀粉能力的大小。

酪氨酸水解能力是鉴定芽孢杆菌的一项重要指标。取L-酪氨酸0.5g悬浮于100mL蒸馏水中，肉汤琼脂培养基100mL，115℃，30min分别灭菌，混匀倒平板，两点接种，30℃培养7～14d，菌落周围或下面呈透明，表明酪氨酸已被分解。

某些芽孢杆菌能产生苯丙氨酸酶，它能使苯丙氨酸氧化脱氨，形成苯丙酮酸。苯丙酮酸遇FeCl呈蓝绿色，培养基配方如下：酵母膏3g，Na2HPO41g，NaCl 5g，L-苯丙氨酸1g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，调节pH7.3。斜面表面划线接种，30℃培养7～21d后，取10％FeCl。水溶液4～5滴滴加斜面上，斜面和试剂液面呈蓝绿色时为阳性。

卵磷脂酶可分解卵磷脂生成脂肪和水溶性的磷酸胆碱。培养基配制方法是在无菌操作下取出卵黄，加等量的无菌生理盐水摇匀后，取10mL的卵黄液加到已溶化并冷却至50℃的200mL的肉汤琼脂中，摇匀、倒平板。采用三点接种，30℃培养1～7d，菌落周围形成乳白色浑浊环或透明环，表明卵磷脂已被分解。

某些芽孢杆菌能把硝酸盐还原形成亚硝酸盐、氨和氮等，如果培养基中的硝酸盐被还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐和对氨基苯磺酸发生重氮化作用，生成对重氮苯磺酸，后者与α-萘胺作用，生成红色的N-α-萘胺偶氮苯磺酸，使培养基溶液呈粉红色、玫瑰红色、橙色和棕色。实验的方法是将待测菌接种于硝酸盐培养基中，30℃培养，分别在1d、3d、5d、7d、14d取部分培养液于一干净试管中，分别加格利斯（Greiss）试剂的A液和B液各一滴（A液：对氨基苯磺酸0.59，10％稀醋酸150min；B液：α-萘胺0.1g，蒸馏水20mL，10％稀醋酸150mL），在不接种的培养基对照管中同样加入试剂，当培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色和棕色时为硝酸盐还原阳性。但是亚硝酸盐可能是终产物，也可能是中间产物。如无红色出现，则加1～2滴二苯胺试剂（二苯胺0.5g，溶于100mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释），培养液变为蓝色，表示培养液中仍有硝酸盐存在，表明硝酸盐还原成阴性；如不成蓝色，表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐都还原成其他物质，故仍按硝酸盐还原阳性处理。注意：硝酸盐还原是在较为厌氧的条件下进行的，因此，液层要厚些。有些反应迅速，测试要及时。

芽孢杆菌某些菌株产生色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成无色吲哚，当加入对二氨基苯甲醛试剂（对二氨基苯甲醛5g，异戊醇75mL，浓HCl 25mL），与吲哚作用形成玫瑰吲哚。采用1％蛋白胨水溶液培养基接种，30℃培养7d和14d，在每支试管中加试剂摇动试管，醇层变为粉红色为阳性反应，表明有吲哚产生，如呈黄色，则为阴性反应。

芽孢杆菌中某些种能将甘油氧化脱氢形成二羟基丙酮，后者的酮基可将斐林试剂中呈蓝色的酮盐还原为砖红色的Cu2O形成沉淀，因而，当平板上加入斐林试剂后，在菌落周围能形成红色的晕圈。培养基配方：酵母膏10g，甘油20mL，肉汤液1000mL，调节pH7.2～7.4。三点接种，30℃培养10d观察。所用试剂为A液：结晶硫酸铜34.66g，蒸馏水定容到500mL；B液：酒石酸钾钠175g，NaOH 50g，蒸馏水定容到500mL。A、B等量混合倒入并覆盖平板，2h后观察菌落周围出现红色晕圈者为阳性反应，可用多黏芽孢杆菌做阳性对照。

在酸碱度不同的培养基中，芽孢杆菌的生长可能会存在差异。选用pH5.7的细菌培养基，用菌液小环接种，同时接pH6.8培养基做对照，30℃培养1～14d，观察不同酸碱度下芽孢杆菌的生长情况。

不同的生长温度对芽孢杆菌的影响较大，采用细菌培养基用菌液小环接种，分别于30℃、40℃、50℃、55℃、60℃水浴培养5d，培养时培养液要十分清晰，水浴面要高于培养液面。目测生长情况，与未接种的对照管比较，注意浑浊度、沉淀物和悬浮物。

溶菌酶能分解细菌细胞壁的肽聚糖，很多芽孢杆菌对溶菌酶有抗性。将0.01g溶菌酶加入至一只含65mL无菌0.01mol/L HCl的100mL三角瓶中，用无菌棉塞塞住瓶口，小火煮沸20min后，冷却至室温，用无菌的0.01mol/L HCl补足100mL。取1mL与99mL无菌肉汤混合，在含有0.001％溶菌酶的无菌肉汤及无溶菌酶的无菌肉汤各接种小环菌液。30℃培养7～14d观察生长情况。

一检测芽孢杆菌耐盐性。分别用含2％、5％、7％、10％NaCl肉汤液1000mL，调节pH7.2，用菌液小环接种，与不接种的对照管一起30℃培养7～14d，观察生长情况。

本书将主要针对课题组研究过的一些具有益生作用的芽孢杆菌进行介绍。