1.4　益生芽孢杆菌研究与应用

芽孢杆菌属（Bacillus spp.）的生理特性丰富多样，是土壤和植物园微生态优势种群之一。与营养体细胞相比，芽孢对热的抗性高105倍或更高，对紫外线和离子辐射的抗性高100多倍，对抗菌素及其他化学药品的抗性也高。当环境条件适宜时芽孢萌发，芽孢壳迅速溶解，随即形成营养体细胞；而在遇到恶劣条件时凝结芽孢杆菌能形成芽孢处于休眠状态以度过困难时期。芽孢杆菌可产生多种抗生素，包括脂肽类、肽类、磷脂类、氨基酸类、核酸类物质，对多种动、植物及人类病原菌起到很好的抑制作用；正因为这些特性，再加上芽孢杆菌还具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，因此，国内外多把芽孢杆菌作为重要的农用微生态制剂出发菌，广泛应用于医药、食品、农业等领域。

益生芽孢杆菌中存在很多特殊功能的菌株，在农业、工业、医学、军事和科学研究中具有广泛的应用价值：部分益生芽孢杆菌菌株可以在高渗、高酸、高碱、高温、高寒的环境下生长良好，具有较大的生态学价值；有的可分泌多种酶类，应用于酶制剂生产；有的可作为多种分泌蛋白基因表达受体，在基因工程和生物学研究领域中有较高的应用价值；除极个别的菌种外，多数菌种与动、植物关系密切并与其形成良好的共生体系，广泛应用于益生菌制剂、微生物肥料的生产；有的菌种能产生对昆虫毒性较强和抑制病菌的蛋白，可应用于微生物农药的生产；炭疽芽孢杆菌可作为生物武器应用于军事领域。芽孢杆菌属在自然界的广泛分布及其产生芽孢的特性，已使其逐渐成为人们高度重视的微生物类群。

1.4.1　益生芽孢杆菌研究意义

（1）促进生物学理论的进一步发展：枯草芽孢杆菌作为模式生物被深入研究了40多年。近来，随着枯草芽孢杆菌基因组测序的完成，研究其在营养条件下维持细菌生命所需的一套最少的基因具有极其重要的意义。其全基因组包括4214810bp序列，通过单一的失活基因发现，枯草芽孢杆菌的4100个基因中只有271个基因是生活必需的。枯草芽孢杆菌还是一种重要的遗传模型系统，特别是它的分泌能力，被应用于大规模的工业生产、药品和生态学研究。炭疽芽孢杆菌全基因组序列测序也已经完成，这是我们更好理解炭疽热发病机理的重要前提。

（2）促进农业生产良性发展：微生物肥料、微生物农药是促进农业生产良性发展的有效措施，芽孢杆菌在这里起着举足轻重的作用，相信对苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌种的深入研究，将促使芽孢杆菌在植物的促生、防病等方面发挥更大的作用。

（3）促进发酵工业快速发展：发酵行业的发展离不开优良的生产菌种，益生芽孢杆菌良好的分泌功能、丰富的菌种资源一定会在酶制剂生产、生化药物生产、食品添加剂等工业领域发挥独特的作用。

（4）保护环境：益生芽孢杆菌能够分泌多种类型胞外酶，在有机磷农药降解、酚类等化学合成物的降解中已经发挥着重要的作用。相信不久的将来还会有更多的益生芽孢杆菌被用于环境保护。

1.4.2　益生芽孢杆菌应用领域

（1）作为生物学理论的模式生物

芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，由于其产生抗逆性较强的芽孢而使其成为一类独特的类群。由于芽孢具有较强的抗热性，所以在医疗、工业发酵等的灭菌过程中，是以杀死嗜热脂肪芽孢杆菌的条件来确定灭菌条件的。表1-6列出一些芽孢杆菌的耐热温度和时间。

芽孢是营养细胞生长到后期时产生的、用于渡过不良环境的一个休眠体，芽孢启动形成的时间和营养细胞的信息接受、信号转导、代谢调控是密切联系的，芽孢的启动形成和成熟反映了基因控制性状在时间和空间的有序性，是时序调控表达的典型代表。

益生芽孢杆菌良好的分泌特性已经成为科学家优先选用的基因表达载体，因此枯草芽孢杆菌作为革兰氏阳性菌的代表菌种在分泌结构、分泌机理和分泌过程等方面的研究成果极大地丰富了分子生物学的理论，也极大地推动了生命科学的发展。

在对芽孢杆菌作为表达载体的研究过程中发现，由于其良好的分泌特性和多数菌株产蛋白酶的特性，使得外源基因表达蛋白量偏低，因此在菌种选育、菌种改造、生产工艺研究等方面进行了更深入的探讨。目前，主要的改进措施有两个方面：一是减少菌株产蛋白酶的量，例如构建蛋白酶突变菌株，采用很少或根本不分泌蛋白酶的菌株，控制外源蛋白在对数生长期分泌，采用蛋白酶抑制剂等；二是增加外源蛋白的分泌量，如采用分子伴侣及相关酶的协助作用，选择合适的信号肽并将其与成熟蛋白融合等。

（2）用于生物农药的生产

自1915年德国科学家Berliner从地中海粉螟分离并命名起，苏云金芽孢杆菌（Bt）一直是生物农药研究的重要来源之一，这一研究也经历了一个漫长的发展过程。美国1928年启动了防治玉米螟计划，1929年第一次在大田应用，1938年法国第一个产品Sporeine面世，20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。从发现该菌至今100多年历史中，世界上有上万篇的研究报道，涉及生物学、分类命名、有效成分、杀虫机理、分子生物学、遗传学、产品化和安全性，包括近年来的转基因植物等诸多方面。

最近研究发现某些非杀虫的Bt株系的伴胞蛋白对体外培养的人癌细胞（MOLT-4、Hela）具有毒杀能力。这类蛋白不属于已知的任何一种Cry/Cyt蛋白，其抗癌活性需经蛋白酶水解活化，所导致的细胞病变有明显的核凝聚和细胞肿胀过程。这个发现可能导致Bt在医疗上的新应用。

通常抗癌药物不能特异地作用于癌细胞，在杀死癌细胞的同时常伴随着正常体细胞的大量死亡。科学家研究发现，Bt 89-T-26-17和Bt 84-HS-1-1l菌株的水解产物能区别MOLT-4和正常T细胞，特异地杀死癌细胞；而Bt 89-T-34-22的毒蛋白虽然也会作用于正常T细胞，但它具有优先杀死MOLT-4的特点，在一定的浓度范围中，只杀死MOLT-4而不影响正常T细胞。这些研究展现了苏云金芽孢杆菌更广泛的应用价值。球形芽孢杆菌的杀虫功能发现较晚，但目前研究已经广泛展开，菌株筛选、发酵生产、杀虫机理、基因工程等方面都有成果发表。另外，具有杀虫作用的芽孢杆菌还有蜂房芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、侧胞芽孢杆菌、日本甲虫芽孢杆菌、缓病芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、生尘芽孢杆菌等。

（3）工业用酶重要生产菌

酶是活细胞产生的具有催化作用的生物催化剂，益生芽孢杆菌产酶研究历史悠久，早在1917年，法国Boidin和Effront首创了用枯草芽孢杆菌生产淀粉酶，在纺织工业中用作退浆剂。1966年，我国自行选育的枯草芽孢杆菌1.398中性蛋白酶投入生产，自此我国的酶制剂工业迅速发展起来。据不完全统计，目前国内已经投产的以芽孢杆菌为主要生产菌株的酶制剂有α-淀粉酶（BF7658、JD32枯草芽孢杆菌）、碱性蛋白酶（2709地衣芽孢杆菌、289短小芽孢杆菌）、中性蛋白酶（1.398、5114和172枯草芽孢杆菌），其他酶如纳豆激酶等也已投入试生产，部分已经批量生产。枯草芽孢杆菌是最早也是最多用于酶制剂生产的菌种，有关枯草芽孢杆菌酶的研究也是最深入的，例如高产菌株的选育、工程菌的研究、蛋白分泌机制的探讨等对提高酶产量和质量都起到了积极的推动作用。

益生芽孢杆菌能够形成的酶类达到几十种，比较典型的是蛋白酶和淀粉酶，其次是甘露聚糖酶、果胶酶、几丁质酶、木聚糖酶、纳豆激酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、脂肪酶、植酸酶等常见酶，还有稀有的酶类，如α-乙酰脱羧酶、超氧化物歧化酶、磷脂酶、木质素酶等。芽孢杆菌产酶的一个典型特点是胞外分泌酶，直接将酶分泌到培养基中，简化了工艺流程，从而节约了成本，适合于工业化生产。

（4）制作多种微生物肥料

微生物肥料是一类含有活微生物的特定制剂，应用于农业生产中，能够获得特定的肥料效应。能够用作微生物肥料的芽孢杆菌种类很多，按其作用机理可分为根瘤菌肥料、固氮菌肥料、解磷类肥料、解钾类肥料等。

我国最早把益生芽孢杆菌作为微生物肥料生产菌种是在20世纪50年代，到现在已有近60年的历史。当时，从苏联引进了能进行自生固氮的圆褐固氮菌、能够解磷的磷细菌巨大芽孢杆菌和解钾的硅酸盐细菌胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）作为生产菌种生产微生物肥料，这些微生物肥料曾经给我国农业生产带来了一定的增产效益。早在1958年，我国就明确提出要发展细菌肥料并写入国家农业发展纲要中。虽然经过了一些波折，但到2000年，微生物肥料被国家科技部列为高科技产品并作为优先发展的农业项目。目前，我国微生物肥料的生产厂家超过400家，年产量达到500万吨左右。

经过几十年的研究和探索，我国已经自行筛选出多株有肥效功能的芽孢杆菌，如有固氮作用的短小芽孢杆菌、固氮芽孢杆菌（B.azotofixans）等10多种，解磷的巨大芽孢杆菌、侧胞芽孢杆菌等，解钾的多黏芽孢杆菌、环状芽孢杆菌等。部分菌株已经投入生产。

益生芽孢杆菌不仅具有固氮、解磷和解钾的功能，而且还能分泌多种抗菌杀菌物质抑制多种病虫害的发生，如脂肽类、肽类、磷脂类、类噬菌体颗粒、细菌素、几丁质酶、蛋白酶等，不仅能够抑制或杀死病原菌，而且还可以克服病原菌对现有的抗菌素的抗性问题。我国利用芽孢杆菌防治植物病害的应用研究达到了世界先进水平，现已开发出一批生防作用优良的枯草芽孢杆菌菌株如B916、B908、B3、B903、BL03、XM16，蜡状芽孢杆菌R2菌株，短小芽孢杆菌A3菌株和增产菌系列产品等。B916菌株对多种病原真菌和水稻白叶枯病菌都有显著抑制作用，自1991年至今对水稻纹枯病田间防效稳定在50％～81％。南京农业大学生防菌B3（商品名麦丰宁）对小麦纹枯病田间防效达50％～80％。莱阳农学院BL03和XM16菌株对苹果霉心病和棉花炭疽病田间防效达90％。其他具有增产防病作用的芽孢杆菌还有B908、R2等菌株。

益生芽孢杆菌分泌的抑菌物质不仅能抑制植物病虫害的发生，同时还能有效抑制大肠杆菌、结肠炎耶尔森氏菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌和痢疾志贺氏菌等人类肠道致病菌的生长繁殖。

（5）在水产中的应用

在水产上应用的益生芽孢杆菌主要是枯草芽孢杆菌，其成杆状，宽度0.5～0.8μm，长度1.6～4.0μm。在水体或饲料中添加枯草芽孢杆菌制剂，可以有效抑制或杀灭水体中或养殖生物体中的某些有害致病菌，并且能增强有益菌的菌落，而达到防治水产疾病的目的。益生芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，可降解饲料中的某些抗营养因子，饲料转化率提高8％以上，促进鱼类生长。

①益生芽孢杆菌用于净化水质

益生芽孢杆菌可降低水体中硝酸盐、亚硝酸盐的含量，从而起到改善水质的作用。芽孢杆菌还可以通过消灭病原体或减少病原体的影响来改善水质。实验发现添加益生芽孢杆菌控制弧菌等致病菌比添加抗生素更好。芽孢杆菌往往是复合微生态制剂的首选菌株。

②益生芽孢杆菌用于饲料防霉

在对芽孢杆菌B13（Bacillus sp.B13）抑制真菌作用的测定实验中发现：芽孢杆菌B13对各供试细菌均有一定的抑制作用。芽孢杆菌B13对白曲霉和黑曲霉的抑制效果好，对黄曲霉、啤酒酵母和根霉的抑制效果次之，对青霉的抑制较差。可见，适当在粮食、饲料及其制品中添加芽孢杆菌B13，能够起到防霉作用，延长仓储时间。