1.7　修复重金属污染废水的微生物

1.7.1　修复微生物的种类

微生物修复的概念分为以下两类[3]。

①广义的生物修复:指一切以利用生物为主体的环境污染的治理技术。它包括利用植物、动物和微生物吸收、降解、转化土壤和水体中的污染物，使污染物的浓度降低到可接受的水平，或将有毒有害的污染物转化为无害的物质，也包括将污染物稳定化，以减少其向周边环境的扩散。一般分植物修复、动物修复和微生物修复三种类型。根据生物修复污染物的种类，可分为有机污染生物修复和重金属污染的生物修复和放射性物质的生物修复等。

②狭义的微生物修复:是指通过微生物的作用清除土壤和水体中的污染物，或是使污染物无害化的过程。它包括自然的和人为控制条件下的污染物降解或无害化过程。

重金属的微生物修复就是通过微生物来对环境中重金属离子进行吸收、沉淀、固定、共价转化等方式，把重金属离子转化为低毒产物，从而降低环境中重金属的毒性。目前，研究较多的微生物种类有细菌中的假单胞菌（Pseudo-monansp.）、芽孢杆菌属（Bacillussp.）及根瘤菌属（RhizobiumFrank），包括特殊的趋磁性细菌（Magnetotacticbacteria）和工程菌等;真菌中的酿酒酵母（Saccharomycescerevisia）、假丝酵母（Candida）、黄曲霉（Aspergillusflavus）、黑曲霉（AspergillusNiger）、白腐真菌（Whiterotfungi）、食用菌等和藻类中的绿藻（Greenalgae）、红藻（Redalgae）、褐藻（Brownalgae）、鱼腥藻属（Anabaenasp.）、颤藻属（Oscillatoria）、束丝藻（Aphanizomenon）及小球藻（Chlorella）等。按营养类型可将自然界的微生物分为自养型微生物和异样型微生物，和重金属修复有关的微生物大部分属于自养型微生物。这类微生物在生长繁殖中不需要任何有机营养，完全靠周围土壤而生存，异氧微生物则与之相反，需要提供有机营养物质才能生存。

目前研究比较多，在生产中得到应用的主要是自养微生物，大部分是土著微生物。土著微生物是由固定碳素的光合细菌、抑制病害的放线菌、分解糖类的酵母菌、在嫌气状态下有效分解的乳酸菌等几十种微生物组成的群落。目前在重金属污染废水修复工艺中应用的主要修复细菌见表1.11。

1.7.2　修复微生物的培养与驯化

1.7.2.1　微生物的培养基

微生物从中吸取营养并赖以生存繁殖的介质称培养基，分液体和固体两种形式。液体培养基用于粗略地分离培养某种微生物，而进行微生物的纯种分离则要用固体培养基。修复细菌（自养菌）的液体培养基是由水和溶解在其中的各种无机盐组成的，每种细菌都有自己特有的培养基配方，这些配方是经研究者的试验研究之后提出的[4]。几种常用的修复细菌的培养基介绍如下。

苦味诺卡菌、沟戈登菌和胶质芽孢杆菌所用的培养基配方为：牛肉膏3g、蛋白胨5g、氯化钠5g、水1000mL，pH7.0～7.2。培养方法为：制备液体培养基时，先用精确到0.001g的电子天平称取培养基各组成物质，依次将它们放入盛有蒸馏水的锥形瓶中加热溶解；封装后放入压力蒸汽灭菌器中，在120℃的温度下灭菌30min，冷却后摆于洁净无菌操作台上用紫外灯照射30min，再将保存菌种接种至液体培养基内，放入恒温空气浴振荡箱中，在28℃，160r/min的条件下培养6d后，用高速离心机从含菌液中分离出微生物细胞作吸附剂及检测用。

枯草芽孢杆菌所用培养基配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、葡萄糖20g、水1000mL，pH7.0。培养方法为：制备液体培养基时，先用精确到0.001g的电子天平称取培养基各组成物质，依次将它们放入盛有蒸馏水的锥形瓶中加热溶解；封装后放入压力蒸汽灭菌器中，在118℃的温度下灭菌15min，冷却后摆于洁净无菌操作台上用紫外灯照射20min，再将保存菌种接种至液体培养基内，在恒温空气浴振荡箱中，在30℃、160r/min的条件下培养24h，然后用高速离心机从含菌液中分离出微生物细胞作吸附剂及检测用。

固体培养基是在上述液体培养基中加入1.5%左右的琼脂或一定量的硅胶制成的。首先在加热条件下配成一定浓度的琼脂溶液，将此溶液消毒后再加入无菌过滤的无机盐，用稀硫酸调节好酸度，冷却至常温即制成平板分离用的固体培养基。

1.7.2.2　修复微生物的连续扩大培养

试验与生产实践证明，修复细菌的浓度和活性对吸附降解效果有很大影响。为了研究和生产需要，有时要在短时间内培养出大量符合要求的菌液。大量培养的方法有两种，一种是间断的，一种是连续化的。连续培养效率高于间断培养。以生产中常用的氧化亚铁硫杆菌为例介绍该菌的连续培养过程。通常用含有Fe2+的培养基培养氧化亚铁硫杆菌，培养过程中细菌的繁殖数量或浓度的变化与培养液中Fe2+被氧化的量成正比，为使细菌快速繁殖，需满足以下细菌生长的最优化条件[5]。

①提供细菌生长繁殖所需的营养物质，通过试验确定最佳化培养基配方；

②提供细菌生长所需的足够量O2和CO2；

③控制好细菌生长所要的酸度和温度；

④提供最优菌种和足够的菌种量，为加快培养速度，可适当加大接种量，一般接种量为10%～20%。

在培养过程中，要尽量缩短细菌开始生长的缓慢期，尽快进入对数生长期。培养到一定程度的细菌，在使用前须知道所培养菌液中细菌的含量或浓度，要对培养槽生产的菌液进行计量。细菌计量一般有如下几种方法：比浊法、直接计数法、平皿计数法、稀释法。其中比浊法和直接计数法可计量出一定体积菌液内所含细菌的总数，此总数包括活菌和死菌，而平皿计数法和稀释法测定的是单位菌液体积内的活菌数。

1.7.2.3　修复微生物的驯化

修复微生物在使用之前要进行驯化，使之适应于吸附过程中可能对细菌不利的工艺条件或对于细菌具有毒害作用的物质成分。驯化的办法是逐渐变化不利因素强度之后对细菌进行转移培养，在驯化过程中，那些对新环境不适应的细菌受到抑制或死亡，而某些活力较强的细菌会通过变异等途径，演变成耐受性更强的细菌而活下来，形成对新环境具有耐性的菌株。例如培养细菌耐砷的能力的方法是：首先在装有一定体积培养基的三角瓶中加入较低浓度的砷离子，然后接种入要驯化的细菌进行培养，开始时细菌不适应，要较长时间才能生长繁殖，待细菌适应于此浓度砷的环境开始正常生长后，将它转移到含更高浓度砷的培养基中继续培养。依此类推，每转移一次都提高砷的浓度，经过多次逐渐加大砷的浓度的转移培养，就可以获得对砷具有较强耐受力的菌株。据报道，国外有人通过驯化获得了可耐受25g/L砷的菌株。

1.7.3　修复微生物菌种的采集和分离培养

取50～250mL细口玻瓶，洗净并配好胶塞，用牛皮纸包好瓶口，置于120℃烘箱灭菌20min，冷却后即可用作细菌采集瓶，带采集瓶到需修复的水样中。取样时首先将牛皮纸取下，用一只手拔去瓶塞，另一只手持瓶接取或舀取水样，水样不能装满，须留一定空间存空气。取好样后立即盖好瓶塞并用牛皮纸包好瓶口，带回实验室。

在实验室将配好的细菌培养基用蒸汽灭菌15min，然后在无菌操作条件下将培养基分装于数个洗净并无菌的100mL三角瓶中，每瓶装25mL培养基，然后用洗净干燥的吸液管取1～5mL水样加到各三角瓶中，塞好棉塞放在20～35℃恒温件下静置或振荡培养7～10d。由瓶中取1mL培养液，接种到装有新培养基的三角瓶中同样培养，至少10次以上，每转移一次接种量逐渐减少，只需1～2滴就可以，在转移培养中，借助培养基的高酸度，可杀死淘汰掉一些不耐酸的杂菌。

用上述方法得到的细菌可能是不纯的，如要分离纯菌种，要做平板分离。但一般生产中使用，不需要纯菌种。菌种培养好后，要放在冰箱（4℃）中保存，过一定时间还要取出来重新转移培养，如用加入重金属的培养基保存，可在室温条件下每4～6个月转移一次即可。

平板分离的目的是获得从单一细胞培养出来的纯菌株。方法是将固体培养基熔化倒入培养皿制成平板，然后在无菌条件下，用接种环取上述培养菌液在平板上划线，使所取菌液中的菌体细胞尽量沿划线分散开，然后将划好线的培养皿在20～35℃条件下恒温培养，经10d左右就可看到单个菌株长成的很小的菌落，挑选适当菌落用取样针移到装有数毫升培养基的小试管中恒温培养，一般培养7d左右即可。将此培养液重新在固体培养基上划线培养，如此反复数次分离与培养，就可获得纯菌株。将这些由单一菌落来的培养物分别进行鉴定，具体做法可参见《微生物手册》。

菌种驯化培养好以后，置于冰箱（4℃）保存，但隔一段时间须重新转移培养。工业生产用菌需在专门设备中大量培养。